不吸水链霉菌11371衍生菌种构建及基因工程宿主菌初筛

采用物理、化学等方法对不吸水链霉菌11371(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis subsp)进行诱变,获得78株在菌落形态方面与野生菌不同的衍生菌;并对各种衍生菌株进行了抗生素生物活性、内源性质粒以及外源载体转化等研究,初步筛选出2株具有宿主潜力的衍生菌,为构建11371转化体系提供了生物材料和相关理论基础。     

弗氏链霉菌丝氨酸蛋白酶基因的克隆及表达

从一株具有极强的降解羽毛能力的弗氏链霉菌菌株（Streptomyces fradiae var.k11）中纯化得到了一种丝氨酸蛋白酶SFP2。经蛋白测序,得到部分氨基酸序列,设计简并引物,PCR扩增得到部分基因序列,通过构建基因文库,获得了包括信号肽序列在内的完整的基因sfp2(EMBL收录号AJ784940),开放阅读框全长924bp,包括114bp的信号肽编码序列和810bp的酶原编码序列, 其中成熟蛋白编码基因长576bp,编码191个氨基酸,理论分子量为19.112kD。酶原编码基因和成熟蛋白编码基因均在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中得到了表达,酶原编码基因表达产物具有正常的生物学活性,证明了克隆基因的生物学功能。     

不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因的克隆与序列分析

克隆不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因.以不吸水链霉菌梧州新亚种基因组DNA作为模板,根据已知的胆固醇氧化酶基因的保守序列设计简并引物进行PCR扩增,PCR产物与载体连接、转化,构建重组质粒.获得了不吸水链霉菌梧州新亚种胆固醇氧化酶基因重组质粒,序列测定并分析.     

不吸水链霉菌梧州新亚种基因组文库的构建

以不吸水链霉菌梧州新亚种为材料,提取的总基因组DNA经Sau3 AI不完全酶切。回收20-30kbDNA酶切片段,与经Hpal和BamHI酶切的粘粒载体pKC505进行连接,将连接产物用噬菌体包装蛋白包装。侵染大肠埃希菌DH5α。在舍有安普霉素的LB平板上培养,所得转化子数为12000个,构建成不吸水链霉菌梧州新亚种的基因组文库。以不吸水链霉菌染色体基因组大小为7Mb计算,概括了不吸水链霉菌梧州新亚种约99％的基因组,达到了建库要求的理论值。未扩增文库的滴度为1．2×10^8pfu／L,扩增文库的滴度为4．8×10^11pfu／L,包装效率为每微克DNA1．2×10^5个转化子。随机挑取菌落,提取重组质粒进行酶切电泳分析,均有外源片段插入。基因文库的构建为进一步深入研究梧宁霉素生物合成基因结构及功能奠定基础。     

人生长激素基因的cDNA克隆,原核高效表达及纯化

用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从含有全长人生长激素（ＨＧＨ）基因的ＣＨＯ细胞中获得ｈｇｈ的ｃＤＮＡ,将其克隆入ｐＥＴ－１１ｂ载体中,在大肠杆菌中获得高效表达,表达量占菌体蛋白总量的２０％。经色谱纯化后,纯度大于９５％。     

链霉菌酪氨酸酶基因的克隆与表达

本文综述了近年来对链霉菌酪氨酸酶基因的研究。由酪氨酸酶合成黑色素是链霉菌属各个种的共同特性,并受到酪氨酸酶基因的控制。链霉菌几个种的酪氨酸酶基因已克隆到,其产黑色素的特性使之作为重要的标记基因得以广泛应用,同时,该基因在链霉菌的不同种及不同属的微生物中得到了高水平的表达。链霉菌酪氨酸酶基因表达调控的分子机制也得到较深入的研究。     

不吸水链霉菌基因文库的构建及初步筛选

采用碱裂解法从不吸水链霉菌提取染色体DNA,用Sau3AI对染色体DNA进行部分水解,利用透析袋法回收3.5～9kb之间的DNA片段。以pUC18为载体,用BamHI对其进行酶切,再用热敏磷酸酶去磷酸化,酶切产物与外源DNA按一定比例混合后,加入T4DNA连接酶进行连接。连接产物用受体菌E.coliDH5α进行转化,根据α-互补性质产生的颜色反应,挑选白色菌落,构建了相应的不吸水链霉菌基因文库。分别利用特异性探针2-1-1及1-2-1对不吸水链霉菌基因文库进行筛选,利用DIG-Ⅱ-dUTP对特异性探针进行标记,与基因文库中的阳性转化子进行Southern杂交,通过显色反应对杂交结果进行检测,由于时间关系,暂未筛选出阳性克隆,但这些工作对以后的相关实验研究具有很好的借鉴作用。     

桑氏链霉菌几丁质酶ChiKJ40基因的克隆表达及其抑菌作用

【背景】目前关于桑氏链霉菌(Streptomyces sampsonii)生防基因的研究不多,仅从其基因组中克隆了2个几丁质酶基因片段,其单个几丁质酶的完整基因序列相关研究未见报道。【目的】克隆S.sampsonii KJ40的几丁质酶基因Chi KJ40并进行原核表达,纯化重组蛋白并研究其抑菌作用。【方法】采用PCR扩增法从S.sampsonii KJ40中克隆几丁质酶基因Chi KJ40,连接到表达载体p ET-32a,导入Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达。使用His标记蛋白质微量纯化试剂盒对重组几丁质酶进行纯化,Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的浓度,几丁质酶试剂盒测定粗酶液和纯化酶液的几丁质酶活性。观察重组几丁质酶对桉树焦枯病菌(Cylindrocladium scoparium)、栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、链格孢菌(Alternaria alternate)、紫丝核菌(Rhizoctonia violacea)几种致病真菌的抑菌作用。【结果】Chi KJ40基因(登录号为MF434484)在E.coli中经IPTG诱导表达,获得42 k D的重组几丁质酶,不同浓度IPTG在37°C诱导3 h,蛋白产量无明显变化。0.2 mmol/L IPTG 16°C诱导过夜,重组几丁质酶主要以可溶性形式存在于上清,小部分以包涵体存在于沉淀中。粗酶液几丁质酶活性为0.080 U/m L,酶比活力为0.041 U/mg,纯化酶液几丁质酶活性为0.046 U/m L,酶比活力为0.115 U/mg,纯化倍数为2.8,酶活回收率为57.5%。重组几丁质酶处理后,C.scoparium、C.parasitica和A.alternata菌丝细胞出现分节、膨胀,R.violacea菌丝溶解且部分被破坏成碎片。【结论】Chi KJ40基因的研究补充了S.sampsonii的生防背景,为几丁质酶基因找到了新的来源,并为其应用奠定了理论基础。     

不吸水链霉菌梧州新亚种基因文库的构建

以不吸水链霉菌梧州新亚种为材料,提取的总基因组经Sau3AI不完全酶切,回收3~9 kb DNA酶切片段,用T4连接酶将回收片段按一定比例与经BamHI酶切、南极热敏磷酸酶去磷酸化处理后的pUC18质粒载体连接,热激法转化受体菌E.coliDH5α,在含有IPTG/X-gal和Amp 的LB平板上筛选重组子,所得克隆数为9×103个,以不吸水链霉菌染色体基因组大小为7 Mb计算,概括了不吸水链霉菌梧州新亚种约99%的基因组,达到了建库要求的理论值。随机挑取白色菌落,提取重组质粒进行酶切电泳分析,均有外源片段插入。基因文库的构建,为进一步深入研究梧宁霉素生物合成基因结构及功能奠定基础。     

Cloning and characterization of the carbapenem biosynthetic genes from Streptomyces fulvoviridis

Carbapenem non-producing mutants were isolated from Streptomyces fulvoviridis and divided into six cosynthesis groups. By using one of the mutants as the host and plasmid pIJ385 as the vector, we cloned carbapenem biosynthetic genes from the parental S. fulvoviridis strain. A cloned 6-kb DNA fragment complemented the defects of three mutants each of which had a mutation in different genes. Southern blot hybridization using the cloned 6-kb fragment as probe showed the presence of the nucleotide sequences homologous to the probe in other carbapenem-producing Streptomyces spp. In addition, Streptomyces griseus, a carbapenem non-producer, possessed the sequence homologous to the probe and showed co-synthesis phenomena with some of the carbapenem non-producing mutants of S. fulvoviridis.     

Wistar大鼠Pdia3cDNA的克隆及原核表达

哺乳动物的精卵融合是一个多分子参与的复杂过程,目前只鉴定出几种影响精卵融合的蛋白因子,对其分子机制还知之甚少.其中位于精子上的Pdja3具有二硫键异构酶活性,可能催化其他精卵融合相关蛋白的二硫键变化而参与精卵膜融合.克隆了Wistar大鼠的Pdia3 cDNA片段,长度为1 620 bp,其中编码区为1 518 bp.测序结果显示,编码区内有两个碱基与GenBank公布的大鼠Pdia3cDNA不同,分别为第147个密码子GAG(Glu)的第1位碱基和第410个密码子AAG(Lys)的第3位碱基,前者造成氨基酸替换,后者仅为多态性.此外,还在大肠杆菌中成功地表达并纯化了GST-Pdia3融合蛋白,为下一步研究大鼠Pdia3在体外影响精卵融合和与其它蛋白的相互作用奠定了基础.     

大鼠α-酰胺酶在变铅青链霉菌中的克隆及表达研究

α－酰胺酶（α－ａｍｉｄａｓｅ,α－ＡＥ）催化神经和内分泌系统中活性多肽的Ｃ－端酰胺化,多多肽的生物活性至关重要。以大鼠心房组织的总ＲＮＡ为模板,采用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增获得编码α－酰胺酶的ｃＤＮＡ,并进行了克隆和测序。为了使α－酰胺酶能在链霉菌中分泌表达,将其ｃＤＮＡ与链霉菌酷氮酶酶（ｍｅｌＣ１）信号的编码序列融合得到融合ｍｅｌ／ＡＥ,将ｍｅｌ／ＡＥ插入链霉菌质粒ｐＩＪ６８０,获得重组质粒ｐＩＪ     

中国人肥胖基因克隆及其原核表达载体的构建

为了探讨人肥胖（obesity,OB）基因的生理和病理意义,利用逆转录-聚合酶链式．反应（RT-PCR）方法,从中国汉族成人腹膜后脂肪组织总RNA中扩增出肥胖基因编码区序列（cDNA）．定向亚克隆pUC19质粒,克隆的OBcDNA不含信号肽序列并加入了新的起始密码子ATG,序列分析表明,与日本报道的人OBcDNA相比,多出一个谷氨酸密码子CAG．将OBcDNA定向克隆至原核表达载体pBV220,构建了重组OB基因表达质粒pBV220-OB．SDS-PAGE证实pBV220-OB在大肠杆菌中可表达分子量为16.7KD的特异蛋白带．     

Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶酶原基因的鉴定及在大肠杆菌中的表达

[目的]鉴定来源于吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因;研究其在大肠杆菌系统的克隆与表达;分析该酶与其同源酶的活性中心氨基酸序列.[方法]从本实验室筛选的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus;CCTCC M203062)发酵液中,分离纯化得到谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-MTGase),测得N-端前十个氨基酸序列并与其它链霉菌来源的相应基因序列比较设计引物,扩增得到pro-MTGase 基因,将该基因插入到表达载体pET-20b( )信号肽pelB下游,构建分泌型表达载体pET/pro-MTG,并转化不同的大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS.[结果]获得了pro-MTGase的完整基因序列,多重碱基序列比对表明其与S.platensis和S.caniferus的pro-MTGase基因同源性高达92%.利用Rosetta(DE3)pLysS通过降温至24℃诱导策略,获得部分胞外表达的酶原.SDS-PAGE显示,胞外表达重组蛋白的分子量约为44kDa,与吸水链霉菌表达的天然酶原相符.诱导4 h后发酵液中的重组酶原经胰蛋白酶活化为成熟酶后测得最高酶活为0.24U/mL.[结论]该研究是对吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因的首次报道,也是国内首次利用大肠杆菌实现pro-MTGase的胞外可溶性表达.     

小桐子植物特异性酪蛋白激酶PS-CK1-5基因的克隆及原核表达分析

酪蛋白激酶(casein kinase, CK)作为一类普遍存在的Ser/Thr蛋白激酶，通过调节靶标蛋白的活性与稳定性，在植物整个生理过程及信号转导途径中发挥重要作用。基于同源序列比对，该研究对小桐子(Jatropha curcas)酪蛋白激酶基因家族进行鉴定与表达分析。结果表明，小桐子基因组中共鉴定到7个酪蛋白激酶1基因(CK1)、5个植物特异性酪蛋白激酶1基因(PS-CK1)、3个酪蛋白激酶2α亚基基因(CK2-α)、2个酪蛋白激酶2β亚基基因(CK2-β)，4个亚家族成员在氨基酸长度、等电点及外显子数目等都有其家族特异性。蛋白的氨基酸序列比对表明，小桐子酪蛋白激酶1都包含N端保守激酶结构域，同时其内部都鉴定到典型的激酶活性环基序、ATP结合核心基序、核定位信号肽。qRT-PCR表达分析表明，小桐子JcPS-CK1-5基因在叶片与根中都属于低温诱导基因，可能参与小桐子抗冷性过程。构建其原核表达载体pET-32a-JcPS-CK1-5，并在BL21(DE3)中诱导表达，得到81.6 kD的条带，与理论融合蛋白的分子量一致。这可为小桐子CK基因的功能鉴定及逆境信号转导机制研究提供参考。