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用杆状病毒表达系统重组病毒,在昆虫细胞中表达了完整的含有EBV-LMP1基因3个外显子开放读码框架的长2.3kb的cDNA片段。用重组病毒感染Sf9细胞,用免疫荧光染色,结果表明:48小时表达重组蛋白,72小时细胞较完整,免疫荧光染色强阳性,96小时后细胞出现破碎。我们采集72小时的组织培养上清和细胞破碎裂解液,分别采用SDS-PAGAE、HPLC分子筛法,用免疫蛋白印迹法实验证明,表达的蛋白能被 相似文献
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鼻咽癌患者EB病毒潜伏膜蛋白(LMP1)的特异性细胞免疫研究 总被引:6,自引:0,他引:6
建立了检测EB病毒伏膜蛋持异性杀伤性T细胞功能的一步法,并用于检测鼻咽癌患者外周血中LMP1特异性CTL功能,发现鼻咽癌患者外周血中LMP1特异性CTL功能显著低于正常人群,这可能与鼻咽癌的发病有关。研究还LMP1鼻咽癌的疫苗抗原。为研究鼻咽癌的特异性细胞免疫预防与治疗提供了实验依据。 相似文献
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目的:探讨EBV阳性胃上皮细胞中潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)基因沉默对NF-kB转录表达的影响.方法:以稳定表达LMP1的EBV阳性胃上皮细胞系作为靶细胞,采用化学合成的siRNA特异性沉默LMP1,用RT-PCR和Westem-blotting分别检测其在不同时间段mRNA和蛋白水平特异性沉默效果;Western blotting及免疫酶染色法检测LMP1基因沉默对NF-kB转录表达及核转移的影响.结果:siRNA在mRNA和蛋白水平可特异性沉默LMP1的表达,且有时间效应关系;Westem blotting及免疫酶染色法检测结果显示LMP1沉默可干扰NF-kB表达,导致靶细胞核内NF-kB水平下降,细胞浆内水平升高,而NF-kB总蛋白有下降趋势.结论:LMP1基因特异性沉默能够影响NF-kB表达,抑制其核转移. 相似文献
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随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。 相似文献
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利用基因免疫技术,将重组质粒PBS-LMP-Hyg直接注入BALB/C小鼠骨骼肌中,于第2、4、8周,用间接免疫荧光法检测鼠血清中抗EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)特异抗体,结果表明,所有免疫小鼠(5/5)均产生特异体体,且抗体滴度随时间变化逐渐增高。 相似文献
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目的:利用昆虫细胞表达系统真核表达并纯化小电导钙激活钾离子通道蛋白1(KCNN1)。方法:以基因重组方法构建杆状病毒穿梭质粒reBacmid-KCNN1,将其转染至杆状病毒/Sf9细胞表达系统表达目的蛋白,并用Western印迹鉴定KCNN1的表达水平;用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化裂解细胞上清中的KCNN1,并用Western印迹鉴定纯化结果。结果:KCNN1在Sf9细胞中高效表达,通过亲和层析获得了纯化的KCNN1。结论:膜蛋白KCCN1在昆虫细胞Sf9中的表达与纯化,为深入研究其分子生物学功能提供了材料,也为全长膜蛋白的体外表达提供了一套可借鉴的实验方法。 相似文献
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目的 预测EB病毒潜伏膜蛋白1(Latent Membrane Protein 1,LMPl)的B细胞表位.方法 基于EB病毒基因组序列,采用DNAStar Lasergene软件包中的Protean软件,对LMP1的亲水性,表面可能性,抗原指数及其二级结构中的柔性区域进行分析,并结合吴玉章的抗原指数预测法预测其B细胞表位.结果 B细胞表位最有可能位于潜伏膜蛋白N端第356-358,2-19,249-314区段或其附近,而潜伏膜蛋白N端第185-223区段内或附近也可能存在B细胞表位.结论 用多参数预测EB病毒LMP1的B细胞表位,为鼻咽癌的筛查及抗肿瘤转移靶向治疗的分子免疫学研究奠定基础. 相似文献
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目的:探讨EBV阳性胃上皮细胞中潜伏膜蛋白1(latentmembraneprotein-1,LMP1)基因沉默对NF-kB转录表达的影响。方法:以稳定表达LMP1的EBV阳性胃上皮细胞系作为靶细胞,采用化学合成的siRNA特异性沉默LMP1,用RT-PCR和Westem-blotting分别检测其在不同时间段mRNA和蛋白水平特异性沉默效果;Westernblotting及免疫酶染色法检测LMP1基因沉默对NF—kB转录表达及核转移的影响。结果:siRNA在mRNA和蛋白水平可特异性沉默LMP1的表达,且有时间效应关系;Westem blotting及免疫酶染色法检测结果显示LMP1沉默可干扰NF—KB表达,导致靶细胞核内NF-kB水平下降,细胞浆内水平升高,而NF—kB总蛋白有下降趋势。结论:LMP1基因特异性沉默能够影响NF-kB表达,抑制其核转移。 相似文献
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上皮细胞逃避老化期是细胞永生化过程中一个重要分子事件,端粒酶活性表达是维持人染色体端粒长度、抑制细胞进入老化期的关键因素之一.我们利用最新的端粒酶PCR-ELISA半定量技术,检测永生化早期阶段人胚鼻咽上皮细胞中端粒酶表达的情况,探讨EB病毒在人胚鼻咽上皮细胞永生化过程中的分子机制.结果表明,EB病毒诱导老化前期人胚鼻咽上皮细胞端粒酶表达,从而促使人胚鼻咽上皮细胞逃避老化期、进入永生化早期阶段.此外,我们还首次发现,人胚鼻咽上皮细胞表达端粒酶活性依赖于EB病毒LMP1蛋白的表达水平和LMP1分子的完整性,LMP1可能通过诱导端粒酶活性表达促进人鼻咽上皮细胞永生化.我们的实验为进一步探讨EB病毒诱导人胚鼻咽上皮细胞永生化的作用机制提供了实验基础. 相似文献
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应用RT-PCR技术,从人黑色素瘤Bowes细胞株中扩增出人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)cDNA。序列分析证实,与国外的报道完全一致。将含完整阅读框架的人t-PAcDNA克隆至昆虫细胞表达转移载体pBacPAK8中,获得重组质粒pBac-tPA。应用脂质体共转染法,将pBactPA和线性化杆状病毒BacPAK6DNA共转染Tn-5B-1昆虫细胞。经空斑筛选获得11株重组病毒。经PCR鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达t-PA的重组病毒BactPA3。在含胎牛血清的培养基中,t-PA表达活性在感染(MOI≈10)后72h左右达到最高,为3.04×103IU/ml,即相当于1.8×104IU/106细胞;在无血清培养基中,t-PA最高表达水平相差不大,但时间为感染后132h左右。经SDS-PAGE纤维蛋白自显影分析,分子量为68kda左右。与从人黑色素瘤细胞培养液中提纯的天然t-PA相比,其受纤维蛋白原激活的特性、和纤维蛋白的亲和力及在血浆中的失活速率基本相同。表达的t-PA在血液循环中的半衰期为7min。 相似文献
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食用昆虫蛋白质的提取研究 总被引:8,自引:0,他引:8
本研究以家蝇(Musca domestica vicina Maquart)幼虫为材料,采取单一选择试验和正交区组旋转组合设计相结合的方法,筛选出盐提—酸沉淀法作为提取昆虫蛋白质的一种较理想的方法。据实验,此法的提取效率为65.37±0.17%。在单一条件实验的基础上,对蛆浆盐提蛋白过程中的抽提、沉淀分别作4因素和2因素二次正交旋转组合设计,建立4个数学模型,总回归F值均达极显著水平,同时进行了效应分析,通过计算机仿真,获得了盐提—酸沉淀蛋白高产、高效方案。 相似文献
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绿色荧光蛋白基因在昆虫细胞中的克隆与表达 总被引:10,自引:0,他引:10
将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到转移载体pVLneo的多角体蛋白基因(ocu)启动子下游,与杆状病素AcNPV DNA共转染昆虫细胞,通过同源重组和G418筛选,构建了整合有GFP基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的GFP,MW为30kDa,在荧光显微镜下呈现美丽的绿色,荧光光谱表明其激发波长395nm,发射波长509nm。Southern blot杂交证明,重组病毒的1kb EcoRI片段与GFP cDNA探针有很强的杂交信号,这是GFP基因在杆状病毒基因组中整合的直接证据。 相似文献
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水稻矮缩病毒外壳蛋白基因S8在昆虫细胞中的表达 总被引:2,自引:1,他引:2
将水稻矮缩病毒 (RiceDwarfVirus,RDV)外壳蛋白基因S8克隆到杆状菌毒转移载体 pVL1 393中 ,重组转移载体 pVL1 393 S8与线性杆状病毒RP2 3.LacZ共转染草地夜蛾细胞sf9,经过细胞体内同源重组、PCR筛选得到重组病毒RP2 3 S8。重组病毒RP2 3 S8感染sf9细胞后 ,收集细胞 ,并进行SDS PAGE及Western blot检测。结果表明 ,S8基因在昆虫细胞中成功表达 ,且在感染后 96h表达量最高 相似文献
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Epstein-Barr病毒潜伏膜蛋白(LMP)基因在哺乳动物传代细胞中的表达 总被引:2,自引:0,他引:2
EB病毒潜伏膜蛋白(LMP)是由病毒编码的主要的与病毒致宿主细胞潜伏感染有关的蛋白之一。我们用基因重组技术,把含有LMP基因(BNLF1)3个外显子(exon)开放阅读框架(ORF)的长1.80kbp的DNA片段,和能分解HygromycinB的含有SV40早期启动子和HgryomycinB磷酸转移酶全基因(长1025bp)的DNA片段(长1.60bp),同时重组于亚克隆载体pBluescriptSK(pBS)中,并使该重组质粒pBS-LMP-Hyg(长5767bp)在乳地鼠肾传代细胞(BHK)中获得表达。BHK细胞在经此重组质粒转染后,LMP阳性细胞是2%,在HygromycinB的持续压力下,LMP表达细胞率可达20%。3个月后,LMP表达细胞逐渐减少。5个月后,不能测到LMP表达细胞。经免疫荧光和蛋白印迹(Westemblot)实验证实,人鼻咽癌、风湿性关节炎和正常人血清中不含有抗LMP抗体。 相似文献
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中国株丙型肝炎病毒(HCV)结构区蛋白在昆虫细胞中的表达及加工 总被引:3,自引:1,他引:3
利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达了完整的中国河北株丙丙型肝炎病毒结构蛋白。免疫印迹实验结果显示,表达产物中有一系列分子量不同、可以与HCV抗体阳性病人血清反应的蛋白,表明结构蛋白被宿主细胞蛋白酶切割与加工,相应分别为20kD的核心蛋白、32kD糖基化的E1蛋白40kD的未糖化的E2蛋白和70kD糖基化的E2蛋白,另有80kD及100kD的两组前体蛋白。利用表达产物检测慢性HCV感染者血清,发现 相似文献
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大鼠卵巢促黄体激素受体膜外微区(1-341)在昆虫细胞中的表达及其性质的初步研究 总被引:1,自引:0,他引:1
促黄体激素/人绒毛膜促性腺激素受体(LH/hCG receptor)N端膜外微区341个氨基酸残基(简称R341)与激素有很高的亲和力。本文报道编码R341的cDNA在昆虫细胞中的表达及其产物性质的初步研究。SDS-PAGE银染和免疫印迹结果显示,表达产物呈两条带:分子量为38.5Kd的主带和分子量为40.0Kd的次带。配基结合免疫印迹和~(125)IhCG结合印迹分析表明,表达产物R341具有与配基专一性结合的生物活力。竞争性配基结合曲线和Scatchard分析结果显示,重组受体R341和配基hCG有较高的亲和力,与hCG反应的Kd为5.68×10~(-10)mol/L。 相似文献