小麦TaMAPK2基因的克隆及表达分析

该研究从小麦中克隆了1个MAPK基因TaMAPK2。序列分析表明,TaMAPK2基因的ORF为1 110bp,编码369个氨基酸。序列比对分析表明,该基因所编码的蛋白与粗山羊草、水稻、谷子等MAPK蛋白具有较高的一致性,分别为99%、94%、94%。进化树分析表明,TaMAPK2与水稻OsMAPK2的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受渗透胁迫、低温胁迫、高盐胁迫、乙烯和双氧水诱导,受ABA抑制。研究表明,TaMAPK2可能参与非生物逆境胁迫及相关信号分子应答。     

苦荞FtF5H基因克隆及表达分析

阿魏酸-5-羟基化酶(Ferulate 5-hydroxylase)是调控S型木质素合成的关键酶,为研究其在苦荞木质素生物合成途径中的分子机制,该文从苦荞转录组数据中筛选获得一个F5H基因,命名为FtF5H(GenBank登录号:MW455111),采用生物信息学方法对苦荞F5H蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、亚细胞定位、亲疏水性、蛋白质二级结构、蛋白质三级结构、氨基酸结构、系统进化树等进行分析和预测,并运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析FtF5H基因在厚果壳苦荞与薄果壳苦荞的叶、花、茎、果壳中的差异表达。结果表明:(1)FtF5H基因序列包含1395 bp的完整cDNA开放阅读框,编码464个氨基酸。(2)FtF5H蛋白具有P450超家族结构,为亲水性稳定酸性蛋白,不具有跨膜结构域,且为非分泌性蛋白。(3)FtF5H蛋白的二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,三级结构预测显示FtF5H蛋白与5ylw.1.A的相似度较高。(4)系统进化分析显示FtF5H属于CYP84A亚家族。(5)qRT-PCR显示FtF5H基因在两种苦荞中的不同部位均有表达,且在厚果壳苦荞果壳中的表达量是薄果壳的5倍,表达具有极显著差异。该研究为进一步研究苦荞木质素合成的分子调控机制奠定了基础,对苦荞新品种的培育具有重要意义。     

巴西橡胶树HbNAC24基因克隆和表达分析

该研究以巴西橡胶树为实验材料,从橡胶树胶乳cDNA中克隆了NAC转录因子基因(HbNAC24)完整开放阅读框(ORF),并通过酵母实验和实时荧光定量PCR技术,进行转录激活活性分析和表达分析。结果显示:(1)HbNAC24基因ORF为1 167bp,编码388个氨基酸,在N端第7~174氨基酸之间含有一个典型的NAC结构域。(2)酵母实验表明,HbNAC24具有转录激活活性,转录激活区在高度变异C端,具备了NAC转录因子的基本特征。(3)序列比对和系统进化分析表明,HbNAC24蛋白属于NAC转录因子家族中的TIP亚族。(4)实时荧光定量PCR分析结果发现,HbNAC24基因在叶中的表达量显著高于其他部位;割胶和茉莉酸(JA)处理均能够诱导HbNAC24表达上调。研究认为,HbNAC24基因可能参与植物的生长发育和胁迫应答过程。     

葡萄风信子MaFLS基因克隆与表达分析

该研究利用PCR技术从葡萄风信子‘亚美尼亚’中克隆了1个黄酮醇合成酶(FLS)基因,命名为MaFLS。MaFLS的cDNA全长为1 076bp,开放阅读框为999bp,编码332个氨基酸,推测的蛋白质分子量38.51kD,理论等电点为5.09。同源比对和系统进化分析表明,MaFLS基因编码的氨基酸具有黄酮醇合成酶典型的2-ODD超家族保守结构域,与拟南芥和高粱FLS一致性分别为60%和83%。半定量PCR和荧光实时定量PCR表达分析表明,MaFLS在花器官中高表达,在根、茎、叶中微量表达,在完全未着色的花蕾期开始表达并于花完全开放未着色时期到达峰值,之后随花发育表达量逐渐降低。原核表达检测到1条大约38kD的外源蛋白,与预测的蛋白分子量相符。该研究结果为进一步探讨葡萄风信子MaFLS基因对黄酮类物质合成的调控作用奠定了基础。     

牡丹PsAGL6基因克隆与表达分析

该研究在转录组数据分析基础上,通过RT-PCR方法从牡丹(Paeonia suffruticosa.L)品种‘洛阳红’中克隆AGL6基因,并分析了其在不同组织和花型中的表达模式。结果显示:(1)AGL6开放阅读框长度732bp,编码244个氨基酸;结构域分析显示,该基因具有高度保守的MADS MEF2区、K区、AGL6I与AGL6II基序,归类于MADS-box基因家族,命名为PsAGL6,GenBank登录号为MF563611。(2)同源比对分析显示,牡丹PsAGL6与葡萄VvAGL6氨基酸序列相似度最高,达79%。(3)qRT-PCR分析结果显示,PsAGL6在牡丹各器官中均有表达,但营养器官中表达量较低,花器官中表达量较高,其中以萼片最高,花瓣与雌蕊次之;对4种牡丹花型花瓣的表达分析显示,PsAGL6基因在不同花型花瓣中的表达量差异明显,且蔷薇型牡丹花瓣相对表达量最高。研究表明,AGL6基因参与牡丹花器官的形成,为深入研究花器官发育的分子机制提供了帮助。     

小麦3个NAC转录因子基因克隆与功能分析

NAC类转录因子参与植物基因在不同条件、不同发育期的表达调控,在植物的发育、生长及对外界的各种生物和非生物因子的胁迫应答中起关键的调控作用。本研究对非亲和条锈菌小种CYR32侵染诱导的抗条锈病基因Yr5近等基因系Taichung29*6/Yr5的cDNA文库进行筛选及同源克隆,获得了小麦3个NAC类转录因子的cDNA序列。序列分析结果表明,这3个转录因子都具有DNA结合结构域,即NAC结构域,且氨基酸序列在该结构域的A、B、C、D和E5个亚区高度保守;同时发现这3个NAC类转录因子都有核定位信号及相关的转录调控功能区域。通过系统进化树分析,发现其中之一的TaNAC1属于NAC转录因子家族第Ⅰ组的NAP亚组,TaNAC3属于ATAF1亚组,TaNAC5属于NAM亚组;根据系统进化树和相关基因的功能分析,我们推测小麦转录因子TaNAC1、TaNAC3和TaNAC5可能参与植物生长发育调控或对生物、非生物胁迫作出的应答反应。     

地黄GGPPS1基因克隆及表达分析

以地黄为材料,通过分析地黄转录组数据,设计特异性引物,克隆了地黄牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS）基因的cDNA序列,命名为RgGGPPS1,GenBank登录号为KU258808。同时在生物信息学分析的基础上,进行原核表达、纯化以及组织特异性表达分析。结果显示：（1）RgGGPPS1基因开放阅读框为987 bp,编码328个氨基酸。（2）生物信息学分析结果显示,RgGGPPS1蛋白含有2个富含天冬氨酸的基序(DDXXXXDD和DDXXD),与芝麻等双子叶植物中的GGPPS蛋白相似性较高。（3）利用构建的原核表达载体pET 32a RgGGPPS1在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中成功表达RgGGPPS1重组蛋白,采用Ni²⁺亲和层析得到了纯化的RgGGPPS1重组蛋白。（4）荧光定量PCR结果显示,RgGGPPS1基因在根中表达量最高,叶、茎中表达量较低。研究结果为进一步研究RgGGPPS1基因在地黄环烯醚萜苷生物合成途径中的功能奠定了基础。     

柠条锦鸡儿CkLEA4基因克隆及表达分析

LEA蛋白是一种与植物抗逆相关的胚胎发育晚期丰富蛋白。该研究从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制削减杂交文库中筛选到1条LEA蛋白编码基因的部分序列,用RACE技术扩增得到该基因cDNA全长并对其进行了克隆。测序表明该基因cDNA长870bp,其中开放阅读框长510bp,编码169个氨基酸,推测蛋白分子量为17.03kD,等电点为9.3,是一种亲水蛋白。序列比对和系统进化分析表明,该基因属于LEA4基因家族成员,命名为CkLEA4。实时荧光定量PCR检测发现,CkLEA4基因在干旱、ABA和NaCl处理下均受到不同程度的诱导,说明CkLEA4基因可能与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫有关。     

大黄鱼Follistatin基因克隆及表达分析

卵泡抑素(follistatin,FST)是转化生长因子β(Transforming growth factor-β)超家族成员之一,在动物肌肉生长中起重要作用。采用RT-PCR、RACE和常规PCR技术克隆了大黄鱼FST基因。获得的基因序列长3195 bp,其中5’非编码区96 bp,3’非编码区47 bp,含5个外显子及4个内含子。该基因开放阅读框972 bp,编码323个氨基酸,其中信号肽31个氨基酸,成熟肽292个氨基酸。Blast结果表明,大黄鱼FST基因与金鲷FST基因的核苷酸及蛋白序列同源性最高,分别达到96%和99%。FST基因在大黄鱼脑、眼、鳃、肾等多个组织中表达,其中鳃组织的表达量最高,脾组织中表达最低。检测水温19℃、25℃、30℃时大黄鱼不同组织FST基因表达量,眼和肌肉组织中FST基因表达量变化显著,推测FST基因可能在鱼类生长发育中发挥重要作用。     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

小麦TaLEC1基因的克隆及其表达特性分析

为了探讨LEC1基因在小麦(Triticum aestivum L)非生物胁迫应答中的功能,该研究通过RT-PCR结合RACE技术克隆小麦TaLEC1基因,并采用qRT-PCR方法分析了该基因在小麦不同组织以及不同处理下的表达模式,为深入研究小麦LEC1基因在干旱、高温和高盐胁迫下的响应机制奠定基础。结果表明:(1)成功克隆到小麦TaLEC1基因,该基因cDNA序列全长为1 074 bp,其中5′端非编码区23 bp,开放阅读框为741 bp,3′端非编码区310 bp,编码246个氨基酸,具有典型的CBFD_NFYB结构域。(2)实时荧光定量分析显示,TaLEC1在不同组织间表达差异显著,10 d龄幼苗的叶中表达量最高。(3)TaLEC1基因可被植物激素ABA诱导而上调表达,属于ABA依赖型的表达调控通路。(4)PEG模拟干旱胁迫处理后的0.5～1 h,TaLEC1基因呈上调表达;42℃胁迫处理过程中,TaLEC1基因呈稳定上调表达趋势,并在胁迫处理后12 h和48 h时表达急剧上调,分别为对照的52.8倍和34.5倍;NaCl胁迫处理0.5 h时TaLEC1基因迅速上调表达。研究表明,小麦TaLEC1基因参与ABA依赖的胁迫响应,推测可能在小麦耐受高温胁迫和渗透胁迫过程中发挥着重要的脱水保护功能。     

p53 cDNA的克隆及在CV-1细胞中的表达

构建了可在哺乳动物细胞表达人p53基因的重组质粒pSV2neo-p53,并通过脂质体lipofectin介导转染猴肾细胞CV-1,用新霉素类抗生素G418筛选出阳性克隆。用原位杂交法检测转化细胞中的p53 mRNA;用免疫组化ABC法证明转化细胞的胞核中有p53蛋白表达。     

小麦TaWRKY47基因的克隆与表达分析

为了探究小麦WRKY基因的功能,该研究采用RT PCR方法,在小麦叶片组织中克隆WRKY基因,并对其进行生物信息学和不同逆境胁迫下的表达分析。结果表明：(1)成功克隆得到1个小麦WRKY基因,命名为TaWRKY47。(2)TaWRKY47基因开放阅读框长度为900 bp,编码299个氨基酸,含有一个WRKY保守结构域和一个C₂HC锌指结构域,属于WRKY基因家族的第Ⅲ类成员。(3)亚细胞定位分析结果显示,TaWRKY47蛋白定位于细胞核。(4)荧光定量PCR结果表明,TaWRKY47基因在小麦根、茎、叶、雄蕊和雌蕊中均有表达,其中在雌蕊中表达量最高,且受低温、干旱、盐、ABA和H₂O₂等胁迫表达增强,推测TaWRKY47基因参与了小麦的逆境胁迫过程。该研究结果为进一步研究TaWRKY47基因功能与抗逆机制奠定了理论基础。     

棉花耐盐相关基因GhLIMa的克隆与表达分析

LIM结构蛋白是真核生物中一类重要的转录因子,参与基因转录、细胞骨架建成和信号传导等许多发育调控过程。该研究利用RT-PCR方法从棉花陆地棉耐盐材料H15中克隆得到了1个新的转录因子GhLIMa(GenBank登录号为KF601208)。GhLIMa基因包含一个627bp的开放阅读框,编码208个氨基酸残基,分子量为23.2kD。生物信息学分析发现,GhLIMa基因含有2个完整的LIM结构域,GhLIMa与可可、蓖麻、欧洲大叶杨中该蛋白的亲缘关系最近,相似性在78%以上。实时定量PCR分析显示,盐诱导后在棉花耐盐材料‘H15’的根和叶中GhLIMa基因表达量均比敏盐材料‘中棉所12’高,而且响应时间早,说明GhLIMa基因与棉花耐盐性密切相关,推测GhLIMa基因在棉花响应盐胁迫过程中具有重要作用。     

海岛棉GbTCP5基因的克隆与表达分析

该研究根据前期海岛棉的转录组数据,通过PCR技术从海岛棉‘新海21’中克隆1个TCP基因,命名为GbTCP5,其开放阅读框945bp,编码314个氨基酸,预测分子量约34.95kD,等电点8.41;多序列比对结果表明,GbTCP5蛋白含有特征性的TCP保守结构域;进化树分析表明,GbTCP5基因与GhTCP17基因在同一分支。qPCR实验结果表明,GbTCP5基因在35d纤维中表达量较高,暗示其可能参与棉花纤维的次生壁合成。酵母单杂交实验表明,GbTCP5在SD-Trp-His-Ade缺陷培养基上生长并且X-gal检验显蓝色,说明该基因在酵母体内具有转录激活功能。     

茶树谷氨酰胺合成酶同源基因的克隆及表达分析

在实验室前期构建cDNA幼根文库获得谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS,EC 6.3.1.2)同源序列(contig48)的基础上设计引物,通过SMART RACE技术克隆了该基因cDNA全长序列(命名为GS1-2,GenBank登录号:JQ925873.1)。结果显示:(1)GS1-2基因全长为1 710bp,开放阅读框长1 071bp,编码356个氨基酸,预测蛋白分子质量为39.3kD,理论等电点为5.65;核酸序列分析表明,GS1-2基因与从安吉白茶中克隆的茶氨酸合成酶基因相似性为99%。(2)将GS1-2基因克隆至原核表达载体pET-32a和pMAL-c5x,转化至大肠杆菌,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE检测结果表明,pET-32a-CsGS1-2转至Rosetta中诱导表达的蛋白与预测蛋白大小一致,主要以包涵体形式存在;而pMAL-c5x-CsGS1-2转化大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达可产生可溶性蛋白。(3)进一步构建茶树GS1-2酵母表达载体pYES-DEST52-CsGS1-2并转化至酿酒酵母(WAT11)菌液中,添加底物(谷氨酸钠100μmol/L和盐酸乙胺500μmol/L)震荡培养并离心,UPLC-MS测定酶反应产物结果初步表明,目的蛋白不能催化盐酸乙胺和谷氨酸钠合成茶氨酸,但可以合成谷氨酰胺。