脆性组氨酸三联体与复制蛋白A相互作用关键氨基酸残基的鉴定

目的：研究脆性组氨酸三联体（Fhit）对ATR/CHK1通路的影响,在确定Fhit与复制蛋白A（RPA）存在相互作用的基础上鉴定Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基,为进一步研究Fhit特异的信号通路奠定基础。方法：构建一系列Fhit缺失突变体基因Fhit1～Fhit11及6种Fhit点突变体基因,将这些基因插入含GST基因的原核表达载体中,在大肠杆菌中表达并纯化GST-Fhit1～GST-Fhit11融合蛋白、突变体GST-FhitSIYEEL、GST-FhitIY、GST-FhitEL、GST-FhitF、GST-FhitA,以及GST-FhitD融合蛋白,用GST沉降技术研究Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基。结果：Fhit蛋白第112～117（SIYEEL）残基可能是Fhit与RPA相互作用的关键区域,而第114（Y）残基可能是Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基。结论：确定了Fhit与RPA相互作用的关键氨基酸残基,为阐明Fhit在维持基因组完整性方面的机理提供了线索。     

手掌参γ-硫素的原核表达及纯化

目的：在原核系统中高效表达手掌参γ-硫素,并对其进行纯化。方法：通过筛选手掌参cDNA文库获得γ-硫素基因（gcthionin）,分别对其全长及信号肽编码序列缺失的cDNA片段进行PCR扩增,克隆入原核表达载体pET-32（a）,构建重组质粒pET-32（a）/gcthionin和pET-32（a）/Δgcthionin;测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导表达融合蛋白;SDS-PAGE分析后,采用Ni-NTA亲和层析柱及凝胶柱对可溶性蛋白进行纯化,Western blotting鉴定。结果：gcthionin基因开放式阅读框全长225nt,编码一个由74个氨基酸残基组成的蛋白;带有信号肽的重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中以包涵体形式表达;信号肽缺失可以极大地提高外源蛋白的可溶性,该可溶性产物经Ni-NTA柱及凝胶过滤后可获得纯度较高的蛋白,经Western blotting分析,相对分子质量约21.9×10^3处有明显的蛋白条带,与预期蛋白分子大小一致。结论：信号肽编码序列缺失的Δgcthionin可在大肠杆菌中可溶、高效表达。     

汉滩病毒S基因的分段表达及其线性和构象型抗原表位分析

构建汉滩病毒76—118N蛋白及其分别从N-端和C-端缺失的共6个突变体,在大肠杆菌BL-21中进行表达,并对其中一些蛋白进行了纯化。通过Western blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,N蛋白及6个缺失突变体都与组特异性抗体L13F3呈阳性反应,而缺失突变体与型特异性抗体AH30呈阴性反应。构建汉滩病毒76—118N蛋白及其6个缺失突变体的真核表达载体,并在COS-7细胞中进行表达。通过间接免疫荧光试验(IFA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,病人血清与真核表达的N蛋白及6个缺失突变体呈阳性反应。而仅有N蛋白及缺失N端1～30位氨基酸序列的NPN30与型特异性抗体AH30呈阳性反应。证实组特异性抗体L13F3结合的抗原表位位于N端1～30位氨基酸;而C端抗原表位对于型特异性抗体AH30与N蛋白的识别和结合具有重要意义,缺失N端100位氨基酸序列可能破坏羧基端构象型表位,也可以影响N蛋白与AH30的结合。     

Magainin和cecA-mil抗菌肽基因的密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达

选用毕赤酵母偏爱密码子 ,设计合成了新型抗菌肽基因。所合成的magainin基因和cecA mil杂合肽基因全长分别为 1 0 1bp和 60bp ,并在其N端引入kex2裂解位点 ,以保证表达抗菌肽具有天然N端。其中 ,cecA mil杂合肽基因根据cecropinAN端第 1～ 7个氨基酸残基、melittinN端第 5～ 1 2个氨基酸残基所设计合成。基因分别克隆入pPICZα A质粒 ,构建分泌型重组酵母表达载体pPICZα A mag和pPICZα A CM。在AOX1 (醇氧化酶 )启动子调控下 ,类似天然抗菌肽大小的magainin及cecA mil蛋白获得分泌表达 ,其表达量分别为 1 0 5mg L和 1 1 8mg L。初步抑菌活性测定 ,显示两者对金黄色葡萄球菌及E .coliDH5α有较好的抑杀活性。     

肌钙蛋白I2与“孤儿”核受体ERRα1相互作用位点的鉴定

为深入研究肌钙蛋白I2（TNNI2）作为核受体相互作用蛋白参与核受体基因表达调控的分子机制,采用缺失突变联合酵母双杂交技术证明了TNNI2与ERRα1的相互作用位于TNNI2的1～128位氨基酸残基区域.该区域包括TNNI2蛋白的N末端、抑制肽段（96～116位氨基酸残基）和一个核受体结合位点LXXLL模序（即NR盒）.哺乳细胞瞬时共转染实验证实,TNNI21-128缺失突变体不具备辅助活化功能,并能作为负显性突变体完全抑制野生型TNNI2的辅活化作用.研究充分证明TNNI2与核受体的相互作用定位于TNNI2蛋白1～128氨基酸残基,并从侧面进一步证实了TNNI2能辅助核受体反式激活作用的功能.     

粉尘螨变应原第7组分全长基因序列测定与分析

目的：获得粉尘螨变应原第7组分编码基因并了解其分子特征。方法：根据GenBank已公布的Derf7核酸序列设计引物,用RT—PCR扩增获得其编码基因,插入pMD19-T载体进行序列测定和生物信息学分析。结果：获得Derf7全长基因约642bp,与参考序列（GenBankAY283292）同源性达99．7％％,仅在249位”A→G”和439位“C→T”发生点突变,含1个完整的开放读码框。推测编码蛋白由213个氨基酸组成,信号肽序列位于1-17aa,亲水性指数为0．031,跨膜区域位于171—190aa,二级结构由一螺旋（57．28％）、延伸主链（6．57％）和无规卷曲（36．15％）组成;亚细胞定位于细胞质,含有N-糖基化位点1个（151-154aa）,蛋白激酶c磷酸化位点1个（193-195aa）,酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点2个（155—158aaand173．176aa）。N端酰基化位点1个（97—102aa）。粉尘螨和屋尘螨变应原第7组分氨基酸序列相似度为86％,二者在螨类第7组分氨基酸序列构建出的分子进化树中聚成一簇。结论：获得了Derf7全长基因,为进一步获得其基因工程制品用于临床和实验研究奠定了基础。     

甜荞FaesSTK基因在长花柱长雄蕊突变体lpls中的表达分析

采用RACE技术,从甜荞（Fagopyrum esculentum Moench）中克隆获得3种花型的STK同源基因FaesSTK,并对其序列特征进行分析。结果显示,甜荞3种花型植株STK同源基因序列一致,全长为967 bp,包含长689 bp的完整开放阅读框,编码一个由225个氨基酸残基组成的D类MADS-box转录因子。蛋白序列比对及系统发育分析结果表明,FaesSTK蛋白属于MADS-box转录因子中的STK进化系。包含1个由57个氨基酸残基组成的高度保守的MADS结构域;1个由82个氨基酸残基组成的次级保守区域的K结构域,在C端的转录激活区还含有另外2个高度保守的基序（AGⅠ和AGⅡ）。实时荧光定量检测结果显示,FaesSTK基因主要在甜荞lpls突变体的雄蕊、雌蕊和不同发育时期的幼果中表达,在根和花被片中仅能检测到微弱的转录信号,在叶和茎中不表达,其中在雌蕊和果实中的表达量极显著高于其他组织。推测该基因在花发育过程中可能主要参与调控甜荞lpls突变体雌蕊和果实的发育。     

原壳小球藻番茄红素ε环化酶基因的克隆和分析

摘要：【目的】番茄红素ε环化酶（lycopene epsilon cyclase）是叶黄素代谢途径中处于分支位点的关键酶。它催化线性的番茄红素选择性环化,形成胡萝卜素,再进一步合成叶黄素（lutein）。本研究的目标是克隆原壳小球藻（Chlorella protothecoides CS-41）LCYE基因的全长cDNA,通过该基因的生物学信息分析预测其表达产物的空间结构与功能位点,并验证该表达产物的生物学活性。【方法】采用cDNA末端快速扩增（rapid-amplification of cDNA ends）和RT-PCR技术克隆原壳小球藻LCYE基因的全长cDNA序列。分别采用PredictProtein、Pfam HMMs和Swiss-Model等在线分析软件分析LCYE的基本生物学信息,预测蛋白质功能位点和空间结构。利用pET28-a(+)构建LCYE基因的原核表达质粒pET-LCYE,并转入大肠杆菌BL21（DE3）,再利用IPTG诱导LCYE基因超量表达。此外,携带pAC-LYC质粒的大肠杆菌工程菌能够积累番茄红素,可用于验证LCYE基因编码蛋白的酶活。【结果】获得了原壳小球藻的LCYE基因的cDNA序列,长2107 bp,GenBank登录号为FJ752528。序列分析表明：它含有1731 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码576个氨基酸,与高等植物和其他藻类的LCYE有很高的相似性,其中相似性最高的是莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii XM001696477.1）,达到67%。第48～459个氨基酸残基为一个典型的番茄红素环化酶蛋白（Lycopene cyclase protein）结构域（pfam05834）,第261～284个氨基酸残基为一个典型的环化酶保守的模体。SDS-PAGE检测表明,LCYE基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到了超量表达。携带pAC-LYC质粒的大肠杆菌工程菌在获得LCYE基因后,其颜色从粉红色变为黄色。【结论】原壳小球藻LCYE基因的全长cDNA为2107 bp,预测出番茄红素ε环化酶所特有的保守功能区域,构建了它的三维结构模型。同时,阐明了小球藻和衣藻的亲缘关系。最后,证实了本研究克隆到的LCYE基因编码的蛋白具有番茄红素ε环化酶的功能与活性。     

烟实夜蛾触角化学感受蛋白cDNA的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

利用RT-PCR技术扩增了编码烟实夜蛾 Helicoverpa assulta 触角化学感受蛋白（chemosensory protein）的全长cDNA。克隆和测序结果表明,烟实夜蛾化学感受蛋白基因核苷酸序列全长384 bp(GenBank序列号： DQ285667),编码127个氨基酸残基,预测N-末端包含16个氨基酸组成的信号肽序列,因此估测其成熟蛋白分子量为12.97 kD,等电点为5.32。将该基因重组到表达载体pGEX-4T₂中,并转入原核细胞中进行表达。SDS-PAGE和Western印迹分析表明,经IPTG诱导后,烟实夜蛾化学感受蛋白基因能在大肠杆菌BL21中表达,电泳检测到一条约39 kD的外源蛋白,与预测的融合蛋白分子量大小相符。     

单核细胞增多性李氏杆菌野毒株InlB的分子特征及其表达和纯化研究

采用PCR技术扩增单核细胞增多性李氏杆菌TA野毒株内化素B(InlB)基因,进行编码分子的序列和结构分析,并克隆入大肠杆菌表达载体pET28a中诱导表达。该基因全长1893bp,编码630个氨基酸,其中前35个氨基酸残基构成信号肽序列。在推导的InlB蛋白氨基酸序列中,从N端到C端分别包括1个α-螺旋的Cap结构域、6个富含亮氨酸的重复基序(LRR)、1个免疫球蛋白样结构域(IR)、1段B重复序列和3个串联的GW结构域,同时还存在5个潜在的N-联糖基化位点,Leu占所有氨基酸残基的10.2%。与GenBank已经报道的18个不同流行株InlB基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列的同源性分别在91.1%~99.6%和92.3%~99.8%之间。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE和Western blot分析证实该基因已经正确表达。用Ni2 亲和层析柱纯化了InlB重组蛋白。     

剪接因子1N端1-320氨基酸片段的原核表达及纯化

目的:通过扩增剪接因子1(SF1)的N端1-320氨基酸(aa)片段对应的cDNA,构建His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),在大肠杆菌中诱导表达并进行亲和纯化。方法:PCR扩增SF1的1-320 aa片段对应的cDNA,扩增产物和载体pET-28a(+)经酶切回收,连接载体和目的片段,获得重组质粒,转化大肠杆菌DH5α,挑取克隆、酶切鉴定、测序,将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE和West-ern印迹分析蛋白表达情况,亲和纯化His-SF1(1-320aa)。结果:SF1片段以正确的读框插入pET-28a(+),IPTG可以诱导大肠杆菌表达重组蛋白,SDS-PAGE和Western印迹证实得到相对分子质量约为40×103的蛋白,亲和纯化得到高纯度蛋白质。结论:构建了His融合蛋白原核表达质粒pET-28a(+)/SF1(1-320aa),并获得His-SF1(1-320aa)融合蛋白,为进一步研究SF1和U2AF65之间的相互作用及对剪接体形成的影响提供了基础。     

麻疯树MIPS基因启动子的分离及在烟草原生质体中瞬时表达活性分析

根据麻疯树MIPS基因序列,设计特异性的巢式引物,运用TAIL-PCR法两次步移得到MIPS基因5＇端侧翼序列,序列分析显示含有多个胁迫应答相关元件,如ABRE、HSE等。以该序列为基础,PCR扩增得到5个5＇端不同长度的缺失片段,分别插入pBI221载体置换CaMV35S启动子,构建的表达载体在PEG介导下转入烟草叶片原生质体进行瞬时表达,检测GUS报告基因的活性。经GUS活性荧光定量检测发现,分离到的MIPS基因侧翼序列5＇端不同缺失片段都能启动GUS报告基因表达,启动活性最高的是WQ1区（-565bp）,核心区位于-565～-449bp。在100μmol·L-1ABA诱导下启动活性增强,但不同区段的增长幅度不同。WQ1区增长幅度最大,比未处理时提高41.4%。     

一个麻疯树RING型锌指蛋白基因JcRFP1的克隆及表达

首次从麻疯树胚乳cDNA丈库中克隆得到一个RJNG型锌指蛋白基（GenBank登录号为JF920726）,命名为JcRFP1。该cDNA长度为728bp,包含编码JcRFP1蛋白的完整开放阅读框（516bp）。脚,基因在麻疯树各器官中均检测到表达且表达量依次为：叶〉茎〉花〉果实〉种子〉根。将克隆到的JcRFP1基因的cDNA序列连接到表达载体pET32a（＋）上,导入BL21（DE3）pLysS菌株,成功诱导表达相对分子质量为33．2kDa的可溶性融合蛋白。该融合蛋白免疫新西兰大白兔,得到效价为1：6500的抗血清。研究表明,JcRFP1蛋白具有体外泛素连接酶E3活性,在麻疯树体内可能参与油菜素甾醇信号转导途径。     

parp10基因RNA干扰有效靶点的筛选及验证

目的：合成并筛选有效抑制parp10表达的siRNA。方法：根据parp10 cDNA序列,设计并合成prap10基因潜在的RNA干扰（RNAi）片段,将合成的寡核苷酸序列构建到pEGFP-C1H1U6载体中;通过双萤光素酶试验、Western blotting筛选有效的干扰序列;进一步用G418对A549细胞进行耐受度筛选,确定最低耐受度;用G418溶液对转染RNAi重组质粒的A549细胞进行筛选,通过RT-PCR鉴定干扰效果。结果：针对617bp处所构建的RNAi载体能够抑制PARP10的表达,用浓度为400μg/mL G418的McCoy′s 5A培养基筛选转染后的细胞,获得了能够表达绿色荧光标签蛋白的A549细胞株,经RT-PCR检测发现,PARP10表达受到抑制。结论：获得了能够有效抑制PARP10表达的特异性小干扰RNA（siRNA）,为进一步研究其生物学功能提供了条件。     

杂交构树UDP-葡萄糖脱氢酶基因编码蛋白的亚细胞定位及其启动子5'端缺失片段的功能分析

为了研究杂交构树UDP-葡萄糖脱氢酶基因（DDBJ，BpUGDH基因登录号为LC457701）启动子不同区域的表达活性，利用5'端缺失及同源重组实验技术，将5个不同长度的BpUGDH启动子5'端缺失片段与GUS基因连接，并通过农杆菌介导法瞬时转化烟草；同时，为了定位BpUGDH基因编码的蛋白在细胞中表达的具体位置，利用GFP报告基因融合目的基因进行蛋白质的亚细胞定位。结果显示：BpUGDH基因启动子-244 bp以内的序列均能介导GUS基因的诱导表达，并且-973、-465、-355、-281和-244 bp之间的区域可能对BpUGDH基因启动子的活性发挥着至关重要的作用。另外，BpUGDH基因编码蛋白的亚细胞定位结果显示：BpUGDH位于叶绿体中。     

2型猪链球菌表面蛋白 Hp0272的原核表达及其结合人血清 IgA 的活性分析

目的：构建带GST标签的2型猪链球菌功能未知表面蛋白Hp0272的原核表达质粒并在大肠杆菌中表达,获得纯度较高的GST-Hp0272重组融合蛋白,鉴定其与人血清IgA（higA）的结合活性。方法：采用分子生物学方法构建pGEX-4T-1-0272重组表达载体,将其转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株,IPTG诱导表达后,通过SDS-PAGE分析蛋白表达情况;用GSTrap柱亲和纯化目的蛋白并经Western印迹验证,采用配体印迹和ELISA方法鉴定GST-Hp0272与hlgA的结合活性。结果：构建了GST融合蛋白原核表达质粒,并获得GST-Hp0272融合蛋白,鉴定到Hp0272特异性地与hisA结合,且结合区域位于Hp0272的N端（41-318an）。结论：获得了GST-Hp0272融合蛋白,并鉴定到其能特异性结合hlgA,为进一步了解Hp0272在猪链球菌致病过程中的作用提供了基础。     

猪链球菌2型05Z33强毒株转录调控因子Rgg基因敲除突变体的构建及毒力分析

目的:构建猪链球菌2型强毒株05ZYH33转录调控因子Rgg的基因敲除突变体,观察其生物学性状,并在动物感染实验中比较敲除株与野生株的毒力差异,为进一步研究猪链球菌转录调控因子在致病中的作用提供实验基础。方法:分别以猪链球菌2型05ZYH33基因组和pSET1质粒为模板,扩增基因SSU05_1997两侧各约500 bp的片段为上下游同源臂,氯霉素(Cm)抗性基因为中间片段,采用重叠PCR方法连接3个片段;连接产物先克隆到T载体上,再经过酶切克隆到温度敏感自杀载体pSET4S上;将构建的基因敲除载体pSET4S-1997电转化入05ZYH33感受态细胞,通过改变培养温度筛选出基因敲除突变体05Z33△rgg;对敲除株和野生株的生物学性状及小鼠和猪的致病性进行了初步比较。结果:PCR分析和测序结果均显示基因SSU05_1997完全被Cm抗性基因所替代,基因敲除突变体构建成功;05ZYH33△rgg对小鼠和猪的致病性与野生株相比无明显差异。结论:转录调控因子Rgg可能和猪链球菌2型的毒力无关。     

弗氏志贺菌5a 型 M90T 株 ClpB 蛋白在大肠杆菌中的融合表达和纯化

目的：构建弗氏志贺菌cZp8基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达后,纯化带T7标签的ClpB蛋白。方法与结果：PCR扩增得到线性化表达载体pET24a与2574bp的c加曰基因片段,利用不依赖连接反应的克隆法（LIC）进行克隆,得到重组质粒pET-ClpB,转入大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达,通过一系列条件优化,确定可溶性表达条件为在30℃下、用1mmol／LIPTG诱导2h;利用抗T7单克隆抗体琼脂糖珠进行亲和纯化,得到了纯度很高的相对分子质量为95×10^3的ClpB-T7融合蛋白。结论：实现了ClpB-T7在大肠杆菌中的可溶性表达,并纯化获得了高纯度的融合蛋白。