技术与方法体外组装含有组蛋白变体H2A.Z及H3.3的核小体

核小体是构成真核生物染色质的基本结构单位,组蛋白变体H2A.Z及H3.3对染色质结构及基因转录过程发挥着重要的调控作用。体内研究核小体及染色质结构受到诸多因素限制,体外重构含有H2A.Z及H3.3的核小体结构是研究与组蛋白变体相关基因表达调控的重要方法之一。实验表达纯化了6种组蛋白,在复性的过程中装配了含有H2A.Z和H3.3的组蛋白八聚体。基于DNA序列10bp周期性及序列模体设计了3条易于形成核小体的DNA序列,通过PCR大量扩增的方法,回收了标记Cy3荧光分子的目的DNA序列。采用盐透析法体外组装了含有H2A.Z和H3.3的核小体结构,利用荧光标记、EB染色及考马斯亮蓝染色检测了含有组蛋白变体的核小体形成效率及形成过程的吉布斯自由能变化。结果发现,设计的3条DNA序列可以有效地组装形成含有组蛋白电梯的核小体结构,而且随着组蛋白八聚体与DNA比例的增加,核小体的形成效率显著提高;采用Cy3荧光标记可以灵敏且定量地计算组装过程的吉布斯自由能。该方法的建立对研究组蛋白变体相关的结构生物学及转录调控等具有一定的意义。     

组蛋白H3变体H3.3及其在细胞重编程中的作用

组蛋白是真核生物中一类进化上相对保守的蛋白质。由组蛋白八聚体及缠绕其上的DNA构成的核小体是真核生物染色质的基本组成单位。核小体使DNA保持固缩状态,既能维持基因组的稳定性,又能保证DNA序列可以正确地进行复制、转录、重组和修复。核小体调控细胞的生物过程除了通过组蛋白翻译后修饰,还可以通过组蛋白变体替换的方式进行。研究发现,组蛋白H3变体H3.3与常规组蛋白H3尽管仅有几个氨基酸的区别,但H3.3却能由特异的分子伴侣介导,整合进入染色质的特定区域,从而发挥不同的作用。同时,H3.3作为一种母源因子在正常受精和体细胞核移植等细胞重编程过程中也发挥着重要作用。本文总结了H3.3的结构特点和富集情况,探讨了特异的分子伴侣及其在细胞重编程中的作用,以期为提高体细胞重编程效率提供新思路,为体细胞重编程的应用奠定基础。     

组蛋白变体H3.3 L27M突变与胶质瘤发生

组蛋白变体在基因表达等基本细胞过程中发挥重要调节功能。人类有5种H3变体,分别为H3.1、 H3.2、H3.3、着丝粒特异性CENP-A和睾丸特异性H3t。人H3.3有H3F3A和H3F3B两个基因编码。采用DNA全基因组测序的方法在儿童高级别胶质瘤如恶性胶质瘤（GBM）和弥漫性内在脑桥胶质瘤（DIPG）鉴定出高频的H3F3A突变。超过70%DIPG和30%GBM携带H3.3 K27M氨基酸错义突变（27位赖氨酸被甲硫氨酸代替）。H3.3 K27M通过与组蛋白H3K27甲基转移酶EZH2亚基相互作用而抑制多梳抑制复合物2（PRC2）活性并全面减少H3K27me3含量。因此H3.3 K27M突变重塑了表观修饰状态和基因表达模式,从而驱动肿瘤发生。K27M突变可作为分子标志物以更好区分儿童胶质瘤亚型,还可作为特异、敏感的预后标志物。通过抑制组蛋白去甲基化酶如JMJD3活性而增加H3K27甲基化可作为K27M突变胶质瘤治疗的有效策略。本文综述了组蛋白变体H3.3 K27M在胶质瘤中的突变模式、分子机制和临床应用。     

Histone H3.3 G34 Mutations Alter Histone H3K36 and H3K27 Methylation In Cis

Histone H3 encoding genes, particularly H3F3A and H3F3B, the genes encoding the variant histone H3.3, are mutated at high frequency in pediatric brain and bone malignancies. Compared to the extensive studies on K27M and K36M mutations, little is known about the mechanism of G34 mutations found in pediatric glioblastoma or giant cell tumors of the bone. Here we report that unlike the K27M or K36M that affect global histone methylation, the giant cell tumors of the bone G34 mutations (G34L/W) only affect histone H3K36 and H3K27 methylation on the same mutated histone tails (in cis), a mechanism distinct from known histone mutations.