应用抑制消减杂交和cDNA芯片技术筛选流行性感冒病毒感染相关基因

病毒基因组有限的编码能力和以病毒蛋白为靶的抗病毒药物易出现耐药性,使从病毒感染宿主筛选病毒感染相关生物大分子作为抗病毒药靶和诊断标志物成为新的研究方向。为了筛选流行性感冒（流感）病毒感染相关基因,采用抑制消减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH)技术,以流感病毒A／鲁防／93－9（H3N2）感染的MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料,构建病毒感染特异性差减cDNA文库。从文库中随机挑取约800个克隆,PCR扩增其中插入片段,经纯化、紫外定量后,用基因芯片自动点样仪点在氨基片上,制备cDNA芯片。将流感病毒感染的MDCK细胞和正常MDCK细胞的总RNA分别用Cy3、Cy5反转录荧光标记后,与cDNA芯片杂交,用芯片扫描仪扫描获得芯片杂交信号,经阳性对照校正和归一化处理后,以如下条件作为判定基因差异表达的标准;（a)Cy3与Cy5的信号比值大于1．5（正常细胞用Cy5标记）或小于0．67（正常细胞用Cy3标记）;（b)Cy3和Cy5信号值之一必须大于1000。经cDNA芯片筛选获得了18个流感病毒感染特异性克隆,经测序和生物信息学分析发现均为流感病毒感染相关新基因EST。流感病毒感染相关基因cDNA片段的获得,为新型病毒药靶诊断标志物发现和功能研究提供了基础。     

大鼠再生肝中表达上调基因的筛选与鉴定

采用新发展的抑制差减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）在基因组水平筛选再生肝中高表达基因。大鼠肝部分切除后24h的再生杆组织来源的cDNA作为受检者（tester）,正常肝组织的cDNA作为驱动者（driver）,进行差减杂交,获得一900个克隆的差减杂交库,随后对差减克隆进行了差异筛选,得到50个在再生肝中高表达的强阳性克隆,序列测定和同源比较表明这些克隆代表了37个基因,其中13个与已报道的肝再生相关的基因同源,15个为忆知基因但首次发现与肝再生相关,9个为新的基因（EST）已被GenBank收录。制备了标准化RNA点杂交膜,通过对上述部分基因的RNA点杂交分析,不但确认了这些基因在再生肝中表达水平的升高,同时发现它们在肝再生过程中有不同的表达模式。实验结果提示这些基因在肝再生过程中具有重要功能。     

利用抑制性扣除杂交技术克隆水稻磷饥饿诱导基因

磷素是植物生长所必需的重要元素.在缺磷环境中,植物能够调节自身的形态、生理生化和基因表达水平来适应环境的变化.为研究水稻(Oryza sativa L.)耐低磷胁迫的分子机理,采用抑制性扣除杂交技术(SSH)构建磷饥饿诱导的水稻根系扣除cDNA文库.通过文库筛选和测序获得18个已知基因和47个功能未知基因.这些基因参与了不同的代谢过程,包括磷吸收和转运、信号传导、蛋白质合成和降解、碳水化合物代谢和胁迫反应.Northern杂交结果表明,在磷饥饿胁迫下这些基因呈现不同的表达模式,并且不同代谢过程中的基因对磷饥饿有着不同的反应.     

利用抑制性扣除杂交技术克隆水稻磷饥饿诱导基因

磷素是植物生长所必需的重要元素。在缺磷环境中,植物能够调节自身的形态、生理生化和基因表达水平来适应环境的变化。为研究水稻(Oryzn sativa L.)耐低磷胁迫的分子机理,采用抑制性扣除杂交技术(SSH)构建磷饥饿诱导的水稻根系扣除cDNA文库。通过文库筛选和测序获得18个已知基因和47个功能未知基因。这些基因参与了不同的代谢过程,包括磷吸收和转运、信号传导、蛋白质合成和降解、碳水化合物代谢和胁迫反应。Northern杂交结果表明,在磷饥饿胁迫下这些基因呈现不同的表达模式,并且不同代谢过程中的基因对磷饥饿有着不同的反应。     

应用抑制性消减杂交技术筛选流感病毒感染宿主应答基因

从宿主系统寻找病毒感染特异性相关的生物大分子是研究病毒药物靶标和诊断标志物的新方向 .为了筛选宿主细胞中流感病毒感染特异性基因 ,采用抑制性消减杂交技术 (SSH) ,以流感病毒A 鲁防 93 9(H3N2 )感染MDCK细胞及正常MDCK细胞为材料 ,构建病毒感染特异性差减cDNA文库 ,PCR法扩增鉴定其中插入片段大小 .从差减文库中随机挑取 10 0个克隆进行测序 ,用生物信息学方法对其同源性和基因功能进行分析和预测 .结果显示 ,成功构建了流感病毒感染特异性差减cDNA文库 ,文库中cDNA片段长度在 2 5 0～ 10 0 0bp之间 .从文库中随机选取 10 0个克隆测序 ,获得了 95个有效序列 ,经blast同源性分析发现 ,大部分基因为参与宿主细胞能量代谢和蛋白质生物合成过程中的基因 ;其中 19个为无任何功能线索的新基因片段 .流感病毒感染特异性差减cDNA文库的建立和筛选出病毒感染应答候选新基因cDNA片段 ,为发现新型流感病毒药靶和诊断标志物以及病毒感染机制研究打下基础     

抑制消减杂交法筛选原发性肝细胞癌中差异表达的基因及其生物学意义

为了筛选原发性肝细胞癌 (hepatocellularcarcinoma ,HCC)中差异表达的基因 ,以了解HCC发生发展的分子基础 ,选取了一例早期高分化肝癌标本作为材料 ,采用抑制消减杂交 (suppressionsubtractivehybridization ,SSH)技术 ,进行了前向及反向消减杂交 ,结合反向Northern印迹筛选 ,得到多个差异表达的基因 .对有意义的基因用半定量RT PCR检测了肝癌中的表达 .结果显示 ,PON2、hSRP1alpha、H4 1在大部分肝癌中表达升高 ,IGFBP1、ITIH1在早期癌症中 ,大部分癌的表达升高 ,在晚期癌症中则表达下降 .EGR1在大部分肝癌中表达降低 .研究表明 ,不同分化程度、不同临床分期的肝癌 ,有共同的或不同的基因表达发生改变 ,明确这些差异表达的基因谱 ,对于肝癌发生发展机理的阐明及肝癌的预防、诊断、治疗都有重要意义 .     

抑制差减杂交法分离玉米幼苗淹水诱导表达基因

以淹水处理(submergence-treated, ST)的玉米(Zea mays L.)幼苗根部cDNA为目标群体,未处理(untreated, UT)的玉米幼苗根部cDNA为对照群体,进行抑制差减杂交.用经过UT差减的ST cDNA构建了一个含有大约2 000个独立克隆的差减文库.对随机挑取的408个克隆进行差异筛选,获得了184个在ST中特异表达或表达增强的候选克隆.对其中155个cDNA克隆测序并去除重复克隆后,共得到95个差异表达的cDNA片段.GenBank中BLAST查询结果表明:6个克隆为已知的玉米核苷酸序列;68个克隆与已知基因或EST序列部分区域的同源性为60%～90%;21个克隆在GenBank中无法查到对应的同源序列,可能代表了新基因,或者由于序列位于变异丰富的3′端而无法查到与其他物种基因的同源性.     

利用抑制消减杂交技术研究结核分支杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra的基因差异

为了解结核病的致病分子机理和筛选结核病致病菌的毒力基因,利用抑制消减杂交（SSH）技术分析了结核分支杆菌强毒株H37Rv和弱毒株H37Ra间的基因组DNA间差异。通过Southern杂交验证及序列分析得到仅在强毒株H37Rv基因组中有的DNA片段8个,其中一个编码已知的毒力因子mce蛋白,1个编码PE家族蛋白,1个编码purC合成酶,和4个潜在蛋白,另一个为非编码区片段。其中有2个基因经PCR方法已证实在强毒株H37Rv和临床分离的强毒株中存在,而在H37Ra和临床弱毒株中无;仅在弱毒株H37Ra基因组中的DNA片段3个,其中2个为新基因片段,已被GenBank收录。     

抑制差减杂交法分离玉米幼苗淹水诱导表达基因

以淹水处理（submergence-treated,ST)的玉米（Zea maysL.)幼苗根部cDNA为目标群体,未处理（untreated,UT)的玉米幼苗cDNA为对照群体,进行抑制差减杂交。用经过UT差减的STcDNA构建了一个含有大约2000个独立克隆的差减文库。对随机挑取的408个克隆进行差异筛选。获得了184个在ST中特异表达或表达增强的候选克隆。对其中155个cDNA克隆测序并去除重复克隆后,共得到95个差异表达的cDNA片段。GenBank中BLAST查询结果表明;6个克隆为已知的玉米核苷酸序列;68个克隆与已知基因或EST序列部分区域的同源性为60%-90%;21个克隆在GenBank中无法查到对应的同源序列。可能代表了新基因。或者由于序列位于变异丰富的3′端而无法查到与其他物种基因的同源性。     

应用差减杂交筛选雪莲低温特异表达基因

目的:获得雪莲低温特异表达基因cDNA全长片段。方法:以低温诱导雪莲为目的材料,常温诱导为对照,采用抑制差减杂交(SSH)方法,构建了雪莲的差减cDNA文库,筛选文库并得到38个cDNA片段。结果:利用GenBank数据库Blastx进行同源性搜索发现有22个非冗余克隆,其中18个已知基因4个未知基因。结论:同源分析表明冷诱导基因和磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)也在其中。所取得的结果为日后进一步对新疆雪莲抗寒机理的研究和更好地分离低温特异表达基因奠定了基础。     

抑制性消减杂交技术在禽类差异表达相关基因筛选中的应用进展

抑制性消减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH)是目前被广泛用于寻找差异表达基因方面的一种技术,因其具有假阳性率低、灵敏度高、重复性好、特异性强等特点而被大多数研究者所采用。该技术的优势在于可以在转录水平对不同环境、不同生理条件下的组织或细胞进行基因差异表达方面的研究。随着近年来分子生物学的不断发展,对差异表达基因的筛选及克隆已逐渐成为研究的热点。本文主要对抑制性消减杂交技术在鹅、鸭和鸡这三种常见禽类的生产性能、抗病机理以及品种差异等方面研究中的应用进行综述,从而为采用抑制性消减杂交技术研究生命活动的分子作用机制提供更多的参考。     

抑制性扣除杂交技术(SSH)及其在基因克隆上的研究进展

抑制性扣除杂交技术是一种基因克隆的新方法,它对研究细胞生殖、发育、分化、癌变、衰老及程序化死亡等生命过程有关基因的差异表达以及相关基因的分子克隆提供了有力的工具,本文简要介绍抑制性扣除杂交技术的主要原理,基本过程、优越性、主要缺陷及目前最新的研究进展     

抑制差减杂交分离赤霉病菌诱导的小麦特异表达基因

为了全面探索小麦赤霉病抗性机理,以抗赤霉病小麦品种‘苏麦3号’及其感病的近等基因系(Hwo4)为实验材料,构建了一个‘苏麦3号’受赤霉病菌诱导表达的正向差减杂交文库。随机选取了141个阳性克隆测序,共获得133条通读EST。将获得的EST去除载体及接头序列后,利用CAP3软件进行聚类分析,133条EST被聚成90个序列重叠群(contigs),片段大小介于106~643 bp间,平均长度为274 bp。利用NCBI的Blastx软件对序列进行蛋白序列同源性比对,结果显示76条序列在蛋白数据库中可以找到同源序列,功能涉及能量代谢、物质代谢、疾病/防御、转录及细胞结构等。其中以能量及物质代谢相关的基因数量最多,分别占总EST的21.1%及17.1%;其次是与抗病及防御反应有关的EST,数量占总EST的15.8%。进一步的分析表明与抗病及防御相关的EST功能主要涉及抗氧化、细胞解毒及相关物质的代谢。     

应用抑制性消减杂交技术克隆大鼠肝再生过程中特异表达基因

应用抑制性消减杂交技术成功地构建了高消减效率的正向消减cDNA文库,从随机挑取的50个克隆中有31个均检出了60~400bp插入片段,对这些插入cDNA片段进行测序后经Genbank同源性检索,表明其中7个片段为未知新序列。大鼠肝切除后肝再生cDNA正向消减文库的建立为进一步大批量筛选、克隆肝再生特异性表达的未知新基因奠定了基础,初步筛选出的特异性表达的序列标记为进一步研究肝再生中基因的功能提供了依据。 Abstract:The cDNA from rat regenerating liver tissue was used as the tester and that from normal liver was used as the driver.A highly efficient subtractive cDNA library was constructed by suppression subtractive hybridization(SSH).After screening,31 clones from 50 clones which were derived from the cDNA library were inserted by 60~400bp cDNA fragments.24 cDNA fragments corresponded to known genes and 7 cDNA fragments were unknown sequences(GenBank accession number:BG447490~447496).     

肺癌消减杂交文库中共同基因的生物信息学分析及验证

抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术因操作简单、筛选效率高、假阳性率低等优点,被广泛用于生物与医学领域．该文拟找出用SSH所建立的10个肺癌差异表达基因文库中重复出现的基因,结果显示,其中6个正向杂交文库中,出现2次的基因有41个,出现3次的基因有4个;其中4个反向杂交文库中,出现2次的基因有6个．进一步用生物信息学分析发现,这些重复出现的差异表达基因参与了多种细胞功能,如基因转录、蛋白翻译、细胞粘附、DNA修复、氧化还原反应等,并涉及多条信号通路．值得注意的是,在这些差异表达基因中,核糖体蛋白相关基因占比最多．然后,用实时定量PCR检测文库中的TIMP3、GPX3、HSP90B1、CD9等基因的表达,结果显示,SSH文库中差异表达基因的上调和下调趋势具有较好的特异性．该研究为发现肺癌相关基因提供有价值的线索．     

抑制消减杂交及其应用

抑制消减杂交(Suppressionsubtractivehybridization,SSH)是以消减杂交为基础结合抑制PCR方法发展起来的分离克隆差异表达基因的一种策略。该方法具有简便易行、特异性高、背景低、重复性好、能分离出丰度较低的特异性片段等特点。主要介绍其原理、方法及其应用,并对方法的优缺点和应用前景作分析。     

Identification of Differentially Expressed Genes During Anther Abortion of Taigu Genic Male Sterile Wheat by Combining Suppression Subtractive Hybridization and cDNA Array

Talgu Genlc Male Sterile Wheat （TGMSW; Trltlcum aestlvum L.）, a dominant genic male sterile germplasm, is of considerable value in the genetic Improvement of wheat because of Its stable Inherence, complete male abortion, and high cross-fertilization rate. To Identify specially transcribed genes In sterile anther, a suppression subtractlve hybridization （aSH） library was constructed with sterile anther as the tester and fertile anther as the driver. A total of 2 304 SSH Inserts amplified by polymerase chain reaction were arrayed using robotic printing. The cDNA arrays were hybridized with 32P-labeled probes prepared from the RNA of forward- and reverse-subtracted anthers. Ninety-six clones were scored as upregulated in sterile anthers compared with the corresponding fertile anthers and some clones were selected for sequencing and analysis In GenBank. Based on their putative functions, 87 non-redundant clones were classified Into the following groups： （i） eight genes Involved In metabolic processes; （11） four material transportation genes; （iii） three signal transductlon-assoclated genes; （iv） four stress response and senescence-associated protein genes; （v） seven other functional protein genes; （vi） five genes with no known function; and （vii） another 56 genes with no match to the databases. To test the hybridization efficiency, eight genes were selected and analyzed by Northern blot. The results of the present study provide a comprehensive overview of the genes and gene products Involved In anther abortion In TGMSW.