Real—time TaqMan RT—PCR快速检测犬瘟热病毒方法的研究

按照犬瘟热（CDV）N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了Real—time荧光定量RT—PCR技术,对细胞培养物、肝脏、肺脏、脑、脾脏、淋巴结以及鼻腔拭子等组织病料中的CDV进行了特异性检测和敏感性试验。同时,利用建立的Real—time荧光定量RT—PCR方法与常规RT—PCR以及韩国BIOINDIST生产的BITRAPIDCDV检测试剂盒对57份临床样品进行了检测。结果：用20pmol／mL的引物浓度各luL和20pmol／mL的探针浓度0.3uL,获得的荧光信号最强,曲线平滑。敏感性高,可检测到1.24×3ng／uL的病毒RNA;特异性强,与NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不发生交叉反应。试验重复性的变异系数（CV）分别为2．3％、2．5％和4.2％;与常规RT—PCR和BIOINDIST生产的BITRAPIDCDV检测试剂盒相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。     

Hendra病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的 建立针对Hendra病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Hendra病毒感染样本的快速检测和准确定量.方法 针对Hendra病毒的保守基因N设计引物和探针,构建体外转录的RNA片段作为标准品,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性.结果 所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Hendra病毒株.本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Hendra病毒,不与Nipah病毒产生交叉反应.检测灵敏度为2.6×100～2.6×101copies/μl.标准曲线的线性范围为2.6×101～2.6×107copies/μl.结论 本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Hendra病毒感染样本的检测.     

Nipah病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的建立针对Nipah病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Nipah病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对Nipah病毒的保守基因N设计引物和探针,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Nipah病毒株。本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Nipah病毒,不与Hendra病毒产生交叉反应。检测灵敏度为1.1×100～1.1×101copies/μl。标准曲线的线性范围为1.1×102～1.1×106copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Nipah病毒感染样本的检测。     

TaqMan—MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒。针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析。结果表明:引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应。方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好。本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测。     

TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR技术快速检测H5亚型禽流感病毒

建立以TaqMan-MGB荧光探针为特点的荧光定量RT-PCR方法,用于检测H5亚型禽流感病毒.针对H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因保守区域设计特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针,筛选并优化荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件,用以提高方法的特异性、敏感性与准确性;并通过体外克隆技术建立病毒基因拷贝数进行定量分析.结果表明引物与探针的优化浓度分别640nmol/L和480nmol/L,体系具有良好的保守性和特异性,与其他呼吸道病毒均无交叉反应.方法检测灵敏度为100拷贝/反应,标准曲线线性范围为107～102拷贝/反应,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,操作简便,重现性好.本研究建立的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行H5亚型禽流感病毒的快速定量检测.     

甲型H1N1流感病毒核酸荧光定量RT-PCR检测技术

目的:建立基于TaqMan荧光探针技术的甲型H1N1流感病毒实时定量RT-PCR方法。方法:分析H1N1流感病毒基因特性,根据新发甲型H1N1流感病毒突变基因片段设计检测引物和TaqMan荧光探针,建立荧光定量RT-PCR检测体系,体外转录制备RNA标准品,进行特异性、敏感性、重复性及盲样检测评价实验。结果:可特异性有效检测新发甲型H1N1流感病毒核酸,与H1～H16流感病毒基因无交叉反应;对RNA标准品的检测敏感性达103拷贝/μL;重复性实验中,阳性标准品Ct值变异系数(CV)10%,阴性标准品检测结果均呈阴性;12份盲样检测结果特异性好。结论:该荧光定量RT-PCR方法可作为甲型H1N1流感防控的病原快速诊断技术。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测方法的建立

为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒的方法。实验结果表明,该方法特异性好、灵敏度高,检测最低浓度为10拷贝/μL数量级阳性标准品。通过对临床样品的检测,证实本研究建立的检测方法具有较好的临床应用价值。     

BDV核蛋白FQ RT-PCR试剂盒的评价与应用

为评价博尔纳病病毒(Borna disease virus,BDV)核蛋白荧光定量PCR(FQRT-PCR)试剂盒的各项指标,比较分子信标探针相对普通探针的优势,并了解其实际检测效果,本课题组使用BDVOL持续感染细胞株、非BDV病毒序列转染的OL细胞、正常的OL细胞,对BDVRT-PCR试剂盒的敏感性、特异性、重复性和稳定性进行评估,同时检测部分临床病人和动物外周血液RNA。实验结果显示:试剂盒可以检测出的病毒RNA最低浓度为2.5×101,相当于1个病毒拷贝数,无非特异检出;不同批次的试剂盒的检测结果变异系数小于0.7;加速破坏的试剂盒和正常试剂盒检测结果之间变异系数在2以内;对临床病人检测阳性率为3.6%,对动物检测阳性率为4.2%(猪)和1.5%(马)。可见该试剂盒重复性和稳定性均好;敏感性、特异性优于普通探针试剂盒,是BDV基础研究、流行病学调查和临床检测的良好工具。     

寨卡病毒、登革病毒、基孔肯雅病毒三重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

本研究旨在建立寨卡病毒(ZIKV virus,ZIKV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)以及基孔肯雅病毒(Chikungunya virus,CHIKV)三种病毒快速筛查、诊断的核酸检测技术。选用ZIKV的NS1基因、DENV的NS5蛋白基因以及CHIKV的E1蛋白基因作为靶标区域设计三组特异性引物探针,建立三重实时荧光定量RT-PCR检测方法。用ZIKV、DENV、CHIKV病毒体外转录RNA和病毒细胞培养物对该方法的灵敏性、特异性、重复性等方面进行评价,最后临床样本以及模拟标本验证。结果显示:三重实时荧光定量RT-PCR检测方法扩增效率均可达到90%以上,三种病毒体外转录RNA最低检测限均低于15拷贝/PCR,病毒培养物最低检出限均低于10PFU/mL且与单重检测方法无明显差异。与其他病毒无交叉反应,变异系数均在2%以内。临床标本及模拟标本检出率均可达95%以上。本研究建立的检测寨卡病毒、登革病毒以及基孔肯雅病毒的三重实时荧光RT-PCR方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于寨卡病毒病等相关临床标本的检测。     

人偏肺病毒TaqMan-MGB探针实时定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

目的:建立人偏肺病毒(hMPV)核酸特异的快速、敏感的TaqMan-MGB探针实时定量RT-PCR检测方法.方法:分别设计hMPV特异的引物与荧光标记探针,合成hMPV绝对定量RNA模板,建立实时荧光定量PCR方法,并与常规RT-PCR平行比较,对其灵敏性、特异性和可重复性,以及用于临床样本的适用性等进行评价.结果:本方法可对hMPV进行特异性诊断,检测灵敏度可达10拷贝/25 μL,检测线性范围至少可达10 1～10 6拷贝/反应,且实验重复性好,初步应用于北京地区采集的158份临床鼻咽拭子标本,定量RT-PCR检出31份标本阳性,明显高于常规RT-PCR方法(22/158).结论:建立了人偏肺病毒TaqMan-MGB探针定量RT-PCR检测方法,并初步证实可用于临床鼻咽拭子标本的检测,为开展hMPV的流行监测及临床早期诊断提供了技术手段.