地衣芽孢杆菌的β－内酰胺酶基因的克隆与穿梭质粒的建造

本文简要报道了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)染色体上的β-内酰胺酶基因的克隆化,及以此基因为基础建造了一批能在大肠杆菌(E．Coli)和枯草杆菌(Bacillus sub-tillis)中都起作用的穿梭质粒的实验。该β－内酰胺酶基因在枯草杆菌中产生大量产物并可分泌到细胞外。     

应用终末荧光产物的发光效应检测聚丙烯酰胺凝胶上的β-内酰胺酶

本文利用β-内酰胺抗生素经β-内酰胺酶水解后,产生终末荧光产物具有发光效应的原理,首次建立了一种检测聚丙烯酰胺凝胶电泳或等电聚焦电泳后凝胶上β-内酰胺酶的方法。该法快速、简便、灵敏、经济,便于推广,实验证明这种方法可以代替传统的Nitrocefin染色法。     

携带SHV类超广谱β-内酰胺酶的吉戈菲肠杆菌北京株的研究

用接合转移的遗传学方法证实了临床分离菌株吉戈菲肠杆菌(Enterobactergergoviae)3773含有一约60kb的可转移质粒,又用测耐药表型、酶水解率及基因片段杂交等方法证实了该质粒上有一编码产生超广谱β-内酰胺酶(Esbla)的基因.其大肠杆菌接合子除了头霉甲氧塞吩(cefoxitin)和亚胺硫霉素(imipenem)外,几乎对所有测定的β-内酰胺类药物都表现耐药,β-内酰胺酸抑制剂——棒酸(clavulanate)可抑制此Esbla的活性.携带此Esbla基因的质粒的一片段可与SHV-1的一结构基因片段杂交,说明此酶是SHV类的Esbla.     

大肠杆菌质粒突变体(p#GTES)的特性分析

大肠杆菌(E.coli)RRI质粒(pGTE5)的β-内酰胺酶基因(β-lactamas gene)可以在E. coli与枯草杆菌(Bacillus subtilis)中复制和表达。但是,在E. coli细胞中向胞外分泌β-内酰胺酶量少,活力低,对氨苄青霉素(Ampicillin,简称Ap)的抗性也低。将该菌株用紫外线(30w,40cm,150s)和硫酸二乙酯双重诱变,在含Ap的LB平板上筛选到已．Coli质粒突变体(p#GTE5)。     

对脆弱类杆菌β-内酰胺酶及其与肠道微生态学关系的初步探讨

本文利用β-内酰胺酶作为分类学研究的方法,探讨了脆弱类杆菌与肠道菌之间的微生态学关系。临床分离菌株脆弱类杆菌55的β-内酰胺酶经离子交换层析、凝胶过滤和制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化,纯酶与脂质体-CPS-K佐剂混合制备抗血清,并建立IgG-ELISA和Western blotting方法,其测定结果均表明脆弱类杆菌的β-内酰胺酶不同于其它类杆菌和肠道菌的β-内酰胺酶,具有种的特异性。     

A环饱和甾体的微生物转化作用II.降解5a一△16一3β一羟基-孕甾烯-20-酮-3β-醋酸酯为△1,4-雄甾二烯-3，17一二酮

节杆菌9—2能彻底降解5a一△16一3β一羟基一孕甾烯一20一酮一3β一醋酸酯(I)形成二氧化碳和水。在它的培养基质中添加钴离子可抑制甾核的进一步降解,从而积累中间产物△1,4-雄甾二烯-3,17一二酮(VI),     

节杆菌9—2对皮质甾类C20-酮基的还原作用II．转化3β，17a，21-三羟基-5a-孕甾-20酮

根据多项物理性质,包括熔点、比旋值、分子旋光度、紫外光谱,红外光谱、核磁共振、质谱等的测定,确定节杆菌(Arthrobacter)9-2生物转化3β,17a,21-三羟基-5a-孕甾-3-酮(I)所生成的产物(Ⅱ)的分子结构为17a,20,21-三羟基-孕甾-1,4-二烯-3-酮,其中C20-羟基的构型是β-型。并讨论了该菌转化(I)的可能途径。     

多粘芽孢杆菌 (Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质分析

从多粘芽孢杆菌 (Bacilluspolymyxa 1794 )中克隆得到 β-葡萄糖苷酶基因bglA。将其构建在大肠杆菌 (Es-cherichiacoli)表达载体pET28a(+)上 ,转化E .coliBL21,获得重组工程菌BL1979。重组表达的 β-葡萄糖苷酶的酶活力达到 247IU mL ,经镍柱纯化后的β-葡萄糖苷酶最适温度为 37℃ ,最适pH值为70 ,该酶经纯化后纯度可达92.7%。用非变性梯度聚丙烯凝胶电泳发现该酶具有多种寡聚体形式 ,经荧光底物活性染色表明这些寡聚体均具有β-葡萄糖苷酶活性.     

大肠杆菌中一种新类型的超广谱β-内酰胺酶

出现于北京协和医院的一耐头孢噻甲羧肟的临床分离菌株大肠杆菌(E.coli 5518),含有一约7.5kb的耐药质粒,编码产生一种新类型的超广谱β-内酰胺酶(Esbla).除了头霉甲氧噻吩和亚胺硫霉素外,产酶菌株对所测定的多种β-内酰胺类药物都耐药.该菌株耐β-内酰胺类药物的特性可接合传递给E.coli JP559菌株,与之一起转移的还有耐氨基糖甙类和磺胺类药物的特性.β-内酰胺酶抑制剂棒酸能抑制此酶的活性.此Esbla基因既不与SHV-1也不与TEM-1的结构基因片段杂交.     

海枣曲霉产生的糖苷酶类

以木聚糖酶、β-D-岩藻糖苷酶活力较高的海枣曲霉作为试验菌株。该菌株的粗酶液含有多种糖苷酶,活力较高的有木聚糖酶、地衣多糖酶、β-木糖苷酶、α-半乳糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶及β-半乳糖苷酶等。其β-D-岩藻糖苷酶活力还高于β-半乳糖苷酶。将海枣曲霉培养不同时间后测活力,表明木聚糖酶在培养的第2天即大量产生,第3天达到高峰。Β-D-岩藻糖苷酶在第4天开     

地衣芽孢杆菌产生碱性蛋白酶的动力学研究

应用自动控制发酵设备,首先进行分批发酵试验摸索了地衣芽孢杆菌2709生长与代谢的基本规律。然后采用补料分批发酵方法限制生长基质浓度,测定了一系列(S_I,μ_I)、(μ_j,q_pj)数据,获得K_S、μ_max、α、β等参数的值,并且推导出了细胞生长与产物合成的动力学公式,从而证明了用Monod方程描述地衣芽孢杆菌2709生长速率与基质浓度关系的合理性和合成碱性蛋白酶的发酵属于生长部分关联型。     

用原生质体融合技术提高α-淀粉酶稳定性

工业生产上一般都采用物理和化学诱变的方法选育优良菌株,Foder和Schaeffer将种内细菌原生质体融合成功之后,用原生质融合方法育种的报道较多,所得融合子也逐渐应用于工业生产.本研究用产α-淀粉酶活力高的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)生产菌株和活力低、耐热性好的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)进行原生质融合,选育出耐热高产的α-淀粉酶产生菌.1 材料和方法1.1 菌种Bacillus amyloliquefaciens BF 7658,北京房山交道酶制剂厂生产菌株;Bacillus licheniformis ATCC9789,中国科学院微生物所保藏.     

β—N-乙酰氨基己糖苷酶产生菌的筛选与产酶条件

筛选了真菌、细菌和放线菌共1121株,其中有β-HexNAcasc活力的有237株,在所筛选菌中只要有β—GlcNAcase活力,也就有β-GalNAcase活力,但两酶比值(β-GlcNAcase／β—Gal-Nacase)不同。所筛选出的溜曲霉(ASP.tamarii)S215为由土壤中分离的,其产酶最适条件为5％麸皮液体培养基,28—30℃振荡培养5—6天,补充碳源如纤维二糖、葡萄糖胺、半乳糖胺或者补充氮源(NH4)2SO4及NH4NO3,可以稍稍提高酶活。在溜曲霉的培养液中除β-GlcNAcase及β-GalNAcase外,还有a-半乳糖苷酶、β一半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-岩藻糖苷酶及α-甘露糖苷酶。     

棉花半乳糖苷酶基因启动子的分离及其在转基因烟草中的表达

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, EC 3.2.1.23)由植物中广泛分布的一类糖基水解酶组成, 被认为与细胞壁多糖的代谢相关. 棉花(Gossypium hirsutum) β-半乳糖苷酶基因已被成功分离, 被命名为GhGal1. RNA杂交实验显示该基因在棉花纤维发育的伸长期优势表达. 为了分析GhGal1基因的时空表达调控, 本研究构建了GhGal1启动子区域(1770 bp)与β-葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase, GUS)基因融合的双元载体, 通过农杆菌转化烟草植株. 对转基因植株分析的结果表明: 此转基因果实中的GUS活性比阴性和阳性对照的活性高. GUS组织定位分析表明: β-半乳糖苷酶基因能在根组织的分生区、子叶、维管束组织、果实和表皮毛中表达. 此外, 调控区域的序列分析揭示该序列含有一些果实/种子特异表达以及与表皮毛表达相关的保守元件. 这些结果显示了GhGal1启动子在转基因烟草植株中的时空表达特征, 并提供了GhGal1基因参与棉花纤维发育的一些重要线索.     

嗜热脂肪芽孢杆菌β-半乳糖苷酶的性质

利用硫酸铵分级沉淀、离子交换层析 (DEAE- 2 2 )、Sephadex G- 75凝胶过滤从嗜热脂肪芽孢杆菌胞内提纯得到 β-半乳糖苷酶。研究表明 ,该酶最适表观反应温度和最适 pH分别为 6 0℃和 6 .4。在 50℃该酶具有良好的热稳定性。碱金属和碱土金属盐对酶有激活作用 ,重金属 Zn²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺抑制酶的活力。巯基保护剂能明显增强酶的活力 ,而巯基结合试剂强烈抑制酶的活性。该酶对 β-     

赤霉烯酮的微生物还原

用Rhodtorula sp.Saccharomyces sp.Arthorbacter sp.和Candida sp．四属20株菌对由Fusarium graminearum 产生的类雌激素——赤霉烯酮(Zearalenone)的还原转化进行了研究。实验结果证明,Rhodotorula sp和 Arthrobacter sp．的还原产物主要是α-赤霉烯醇(α-Zearalenol,经HPLC鉴定含量分别为96％和84％)。Saccharomyces sp．和Candidasp.的主要还原产物是β-赤霉烯醇(β-Zearalenol,经HPLC鉴定含量分别为91％和92％)。产物均经HPLC、13C—NMR和MS鉴定确证。     

安络小皮伞中水溶性多糖的研究I．甘露聚糖FP1的纯化与结构研究

从安络小皮伞水溶性多糖中分离纯化得一甘露聚糖FP1。分子量约为24万。经红外光谱、+H-NMR谱和亲和层析指明为β-甘露聚糖。结构分析采用高碘酸氧化、Smith降解、完全甲基化GC、GC—MS与13C—NMR分析,分子的主链是芦β-D-(1→6)连接的甘露糖,支链为β-(1→3),β(1→2)甘露糖,分别连接在主链的O-3和。O-2上。     

转查耳酮合酶基因矮牵牛共抑制的研究

查耳酮合酶是花色素合成途径的一个关键酶. 将查耳酮合酶基因(chalcone synthase A, chsA)导入矮牵牛(Petunia hybrida)后, 转基因植株的外源与内源chsA基因一起发生共抑制, 导致花色改变. 将β-葡糖苷酸酶基因(uidA)连在chsA基因下游形成融合基因, 通过土壤农杆菌介导的途径转化矮牵牛. 利用GUS组织染色检测到共抑制的发生具有发育特异性, 在花组织发育时期开始发生, 发生的起始需要内源基因与外源基因的相互作用. RNA原位杂交实验表明, 共抑制的发生没有组织特异性, 且初步表明共抑制发生后, RNA可能是在细胞质中发生降解的.     

维生素B12对大腸杆菌β-半乳糖苷酶合成的作用

(一)大腸杆菌Escherichia coli K12M-1 的营养试验及细菌细胞内游离氨基酸变化的分析,确定为稚生素B12缺陷型变种。 (二)在诱导形成β-牛乳糖苷酶时,甲硫氨酸为其必需的物质,如果同时加入B₁₂,则形成诱导酶的活力显著提高。 (三)当有甲硫氨酸存在于诱导系兢中时,a-硫代尿嘧啶有抑制大腸杆菌K12M-1菌株对β-半乳糖苷酶合成的作用,以B12代替甲硫氨酸,这种抑制作用不明显,如果甲硫氨酸与B12同时加入,则B₁₂有抵制a-硫代尿嘧啶对酶合成的抑制作用。 (四)应用标记甘氨酸-1-C14作试验,分析甲硫氨酸与B12对β一半乳糖苷酶合成的作用, 结果指出,甲硫氨酸或B12均能增加甘氨酸-1-C14的参入。如B12加入到含有甲硫氧酸的诱导系统中,则酶此活力较甲硫氨酸或B12单独存在时为高。     

水稻EPSP合酶第一内含子增强外源基因的表达

分离并克隆了水稻5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的第一内含子(EPI). 序列分析表明, EPI长704 bp, GC含量为36.2%. 为进一步研究EPI序列在转基因植物中对外源基因表达水平的影响, 将EPI序列插入CaMV35S启动子和报导基因β-葡糖醛酸酶(β-glucuronidase, GUS)基因(gus)之间. 采用基因枪法转化烟草叶片, gus基因瞬时表达表明, EPI序列的存在可以使GUS的表达水平提高. 利用农杆菌法转化烟草, 获得了gus基因稳定表达的植株. GUS活性检测表明EPI内含子的存在可以显著提高GUS基因的表达(P<0.01). Northern blot 分析表明, 在转录水平上gus基因在含EPI内含子的转基因植株中的表达高于不含EPI gus基因的表达, 并且成熟的gus mRNA中EPI被正确剪取掉了, 表明是一种非转译的内含子. GUS定量检测表明, EPI存在可以使GUS的平均表达水平提高3倍, 最高单株可提高6倍.