西伯利亚鲟AdipoR克隆、组织分布及其对禁食的响应

为了探究西伯利亚鲟脂联素受体的表达特征及其对能量状态变化的响应,研究采用RACE方法克隆获得AdipoR1和AdipoR2的cDNA全长。西伯利亚鲟AdipoR1 cDNA全长为2013 bp,开放阅读框为1146 bp;AdipoR2 cDNA全长为1590 bp,开放阅读框为1086 bp。多重序列比对结果显示,西伯利亚鲟AdipoR1与哺乳类、鸟类、两栖类和鱼类的氨基酸一致性较高, AdipoR2与鱼类氨基酸一致性更高。系统进化树分析显示,西伯利亚鲟AdipoR1与其他硬骨鱼类聚为一支, AdipoR2与斑点雀鳝聚为一支。实时荧光定量结果显示,AdipoR1和AdipoR2 mRNA在西伯利亚鲟组织中均有表达, AdipoR1在中脑、延脑、前脑、小脑和下丘脑中的表达高于外周组织, AdipoR2在中脑、鳃、瓣肠、性腺和延脑的表达相对较高。此外,与其他硬骨鱼类似,西伯利亚鲟AdipoR1和AdipoR2在肌肉中表达较低。当禁食10d时,西伯利亚鲟幼鱼肌肉中AdipoR1和AdipoR2mRNA表达量均显著上调,复投喂后AdipoR1表达显著降低,而AdipoR2表达无显著变化。由上...     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

西伯利亚鲟和鲫鱼脑型一氧化氮合酶cDNA片段克隆及序列分析

实验根据脑型一氧化氮合酶氨基酸高度保守序列设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增并克隆了西伯利亚鲟(Acipenser baeri)和鲫鱼(Carassius auratus)的脑型一氧化氮合酶cDNA片段。西伯利亚鲟cD-NA片段为356 bp,鲫鱼cDNA片段为377 bp。氨基酸序列同源分析发现,西伯利亚鲟与斑马鱼(Brachydaniorerio)的脑型一氧化氮合酶同源性为70%,鲫鱼与斑马鱼的同源性为97.6%。     

西伯利亚蓼非特异性脂质转移蛋白编码序列的克隆及其盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的非特异性脂质转移蛋白(non-specific lipid transfer protein, nsLTP)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列.该序列全长604 bp,其5′非翻译区65 bp,3′非翻译区227 bp,开放阅读框编码103个氨基酸残基;序列分析表明,该基因具有N端信号肽,具有nsLTP家族共有的典型保守区域,属nsLTP家族基因,命名为PsnsLTPs;荧光定量PCR分析表明,PsnsLTPs在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达.在3%NaHCO3诱导表达下,该基因在地下茎中表达明显受盐胁迫的诱导,推测该基因在抵御盐胁迫时具有重要作用.     

鳜碱性肌球蛋白轻链基因cDNA的克隆及其发育表达分析

肌球蛋白轻链是构成鱼类肌纤维主要组成部分,在鱼类肌肉生长和收缩过程中具有重要作用。鳜鱼具有生长快、肉质细嫩、味道鲜美、营养成分高等优良的性状。研究通过构建鳜肌肉组织cDNA文库分离到两个碱性肌球蛋白轻链基因,即MLC1和MLC3基因。序列分析显示MLC1和MLC3基因cDNA序列全长分别为1237bp和1070bp,分别编码192和150个氨基酸,除去MLC1N端多出的42个氨基酸残基,MLC1与MLC3氨基酸序列同源性为80.3%。通过PROSITEtools软件预测显示两种轻链都具有两个保守的EF-手相结构,其中第二个EF-hand结构除前三个氨基酸外同源性达100%。鱼类MLC3轻链N端没有高等脊椎动物MLC3特有标志序列。采用实时荧光定量PCR方法对鳜鱼MLC1和MLC3发育性表达分析表明,在原肠期开始有低量表达,与原肠期、尾芽期和肌肉效应期相比,心搏期和仔鱼期MLC1和MLC3表达量显著升高。研究结果首次提供了鳜肌肉组织肌球蛋白主要结构基因的分子生物学信息以及它们在鳜肌肉组织发生和功能的相关性。       

银鲫肌酸激酶M3-CK cDNA的克隆及其表达特征

用抑制性差减杂交结合SMART cDNA合成和RACE—PCR技术克隆到雌核发育银鲫(Carassius auratus gibelio)肌酸激酶M3-CK基因的全长cDNA。银鲫M3-CK cDNA全长1551bp，编码380个氨基酸，与普通鲤鱼(cyprinus carpio)M3-CK的氨基酸序列同源性高达95％。种系分析表明，银鲫M3-CK与其它脊椎动物的肌肉型肌酸激酶聚为较近的一支，与鲤鱼的M3-CK聚在一起，与脑特异型肌酸激酶及线粒体型肌酸激酶分歧较大。虚拟Northern杂交显示银鲫M3-CK基因在胚胎发育中差异表达。RT—PCR表明，银鲫M3-CK基因在成熟卵母细胞和胚胎发育早期可检测到少量的转录产物，在胚胎发育期间从肌肉效应期开始转录，并一直持续表达。组织RT—PCR表明，银鲫M3-CK基因只在心脏和肌肉表达。     

鳜肌肉生长抑制素Myostatin cDNA克隆与组织表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆了鳜(Siniperca chuatsi)肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)cDNA序列,并分析了该基因的结构特征和亲缘关系。鳜MSTN cDNA序列全长2627bp,包括5′端非翻译区117bp、3′端非翻译区1376bp和开放阅读框(ORF)1134bp,共编码377个氨基酸,含22个氨基酸的信号肽。鳜MSTN具有脊椎动物MSTN的共同序列特征,含有1个蛋白酶水解位点RARR和9个保守的半胱氨酸残基。脊椎动物MSTN氨基酸序列的亲缘关系分析表明,鳜与其他鱼类聚为一支。RT-PCR分析表明,鳜MSTN在成体不同组织中的表达情况不同,其中,卵巢、肾、眼、肌肉、心、脑、皮肤和胃中有表达,肝胰脏未见表达。     

西伯利亚蓼甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的cDNA克隆与序列分析

根据NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼茎部消减库中甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)表达序列标签序列设计引物,采用cDNA末端快速扩增技术,从西伯利亚蓼茎中扩增出GAPDH的全长cDNA序列。该cDNA序列全长1331bp,完整阅读框1014bp,编码337个氨基酸。属于稳定蛋白,具有GAPDH保守功能域。氨基酸组成与其他已知高等植物来自细胞质中的GAPDH基因cDNA序列具有很高的同源性,最高可以达到96%。通过转酿酒酵母INVSC1的NaHCO3和NaCl胁迫试验表明,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)有明显的抗盐胁迫特性。在10%NaHCO3和4mol·L-1 NaCl胁迫下,转基因INVSC1(pYES2-GAPDH)菌株存活率明显比INVSC1(pYES2)高,可以推测GAPDH基因赋予INVSC1(pYES2-GAPDH)抗NaHCO3和NaCl的能力。该基因的cDNA序列在GenBank中登录号为DQ922680。     

半滑舌鳎FTZ-F1cDNA克隆及表达分析

为研究性别相关基因FTZ-F1在半滑舌鳎鱼中的表达特征,采用同源克隆策略,从其精巢分离了3143bp长的半滑舌鳎FTZ-F1(hsFTZ-F1)的全长cDNA,该序列包含1458bp开放阅读框,66bp长的5'末端非编码区(UTR),1619bp长的3'末端UTR。mRNA的组织分布、氨基酸序列和系统发生分析表明:hsFTZ-F1属于SF-1/Ad4BP类群。RT-PCR分析表明:hsFTZ-F1mRNA的分布广泛,几乎在所有组织都有表达,但在性腺、肾脏、脑和头肾组织中表达最强,其他组织表达较弱,雌鱼脑和头肾中的表达量明显高于雄性。胚胎发育过程中表达量都高于孵化后仔鱼的表达量,表明hsFTZ-F1可能参与了半滑舌鳎的器官形成过程。     

西伯利亚蓼谷氨酰胺合成酶基因的克隆及碱性盐胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum Laxm.)地下茎抑制消减文库(SSH)中获得的谷氨酰胺合成酶基因(Glutamin synthetase,GS)EST序列,应用RACE技术克隆了具有Poly A的全长cDNA序列,以下简称为PsGS基因。该序列全长1 273 bp,其5'非翻译区178 bp,3'非翻译区24 bp,开放阅读框编码356个氨基酸残基;根据与其他植物谷氨酰胺合成酶的氨基酸序列的比对以及系统进化分析的结果,确定此基因为谷氨酰胺合成酶基因家族成员;经过SignalP3.0预测该蛋白没有信号肽,无切割位点,为非分泌蛋白。经过ProtParam计算该蛋白的理论等电点为5.55,分子量为39.2 kD,不稳定系数为43.82%,为非稳定蛋白。实时定量PCR分析表明,PsGS在西伯利亚蓼叶、茎、地下茎中均有表达。在3%NaHCO3诱导下,该基因在叶和茎中表达升高,在地下茎中表达受到抑制,推测该基因在抵御碱性盐迫时具有重要作用。     

Specification and determination of limb identity: evidence for inhibitory regulation of Tbx gene expression.

Limb-type-specific expression of Tbx5/Tbx4 plays a key role in drawing distinction between a forelimb and a hindlimb. Here, we show insights into specification and determination during commitment of limb-type identity, in particular that median tissues regulate Tbx expressions. By using the RT-PCR technique on chick embryos, the onset of specific Tbx5/Tbx4 expression in the wing/leg region was estimated to be stage 13. Specification of the limb-type identity is thought to occur before stage 9, since all explants from stage 9 through 14 expressed the intrinsic Tbx gene autonomously in a simple culture medium. The results of transplantation experiments revealed that axial structures medial to the lateral plate mesoderm at the level of the wing region are capable of transforming leg identity to wing identity, suggesting that a factor(s) from the median tissues is involved in the limb-type determination. Nevertheless, the transplanted wing region was not converted to leg identity. The results of the transplantation experiments also suggested that wing-type identity is determined much earlier than is leg-type identity. Finally, we also found that inhibitory effects of median tissues mediate the specific expression of Tbx5/Tbx4 in the presumptive wing/leg region. We propose a model for limb-type identification in which inhibitory regulation is involved in restricting one Tbx gene expression by masking the other Tbx expression there.     

Sequence variation in the Tbx4 gene in marine mammals

The amino-acid sequences of the T-domain region of the Tbx4 gene, which is required for hindlimb development, are 100% identical in humans and mice. Cetaceans have lost most of their hindlimb structure, although hindlimb buds are present in very early cetacean embryos. To examine whether the Tbx4 gene has the same function in cetaceans as in other mammals, we analyzed Tbx4 sequences from cetaceans, dugong, artiodactyls and marine carnivores. A total of 39 primers were designed using human and dog Tbx4 nucleotide sequences. Exons 3, 4, 5, 6, 7, and 8 of the Tbx4 genes from cetaceans, artiodactyls, and marine carnivores were sequenced. Non-synonymous substitution sites were detected in the T-domain regions from some cetacean species, but were not detected in those from artiodactyls, the dugong, or the carnivores. The C-terminal regions contained a number of non-synonymous substitutions. Although some indels were present, they were in groups of three nucleotides and therefore did not cause frame shifts. The dN/dS values for the T-domain and C-terminal regions of the cetacean and artiodactylous Tbx4 genes were much lower than 1, indicating that the Tbx4 gene maintains it function in cetaceans, although full expression leading to hindlimb development is suppressed.     

The comparative genomics of T-box genes.

T-box genes are defined by the presence of a conserved sequence, the so-called T-box; this codes for the T-domain, which is involved in DNA-binding and protein dimerisation. Members of this gene family have been found in all metazoans, from diploblasts to humans, and mutations in T-box gene family members in humans have been linked to several congenital disorders. Sequencing of the complete genomes of a range of invertebrate and vertebrate species has allowed the classification of individual T-box genes into five subfamilies: Brachyury, T-brain1, Tbx1, Tbx2 and Tbx6. This review will largely focus on T-box genes identified in organisms whose genomes have been fully sequenced, emphasising how comparative studies of the T-box gene family will help to reveal the roles of these genes during development and in the adult.     

史氏鲟免疫球蛋白重链可变区序列及多样性

为了研究史氏鲟免疫球蛋白重链可变区基因的组织结构和多样性,采用RTPCR技术从史氏鲟(Acipenserschrenckii)脾脏总RNA中获得了免疫球蛋白重链可变区cDNA克隆,随机挑取31个阳性克隆进行测序。结果表明:所有序列相同率高于75%,前导肽相同率高于90%,应属于同1个VH家族。其变异主要存在于互补性决定区,特别是CDR3区。在D片段序列中发现大量保守的基因序列(motif)。并发现多个VH基因片段可以共用一个J片段的现象。在基因组DNA重排过程中,VH片段可以与任意的D和J片段结合。此外,史氏鲟免疫球蛋白重链可变区的VH,D和J片段的随机重排外,外切核酸酶作用,以及在重排位点大量N,P片段的插入现象,都大大增加了鲟鱼免疫球蛋白的多样性。     

胡子鲇Dmrt1基因全长cDNA克隆及其表达分析

以胡子鲇(Clarias fuscus)为研究对象,利用RT-PCR技术和SMART RACE技术克隆获得Dmrt1基因cDNA全长,并利用生物信息学分析其结构及功能;利用半定量RT-PCR技术检测胡子鲇性腺(精巢/卵巢)、肌肉、肠、肝脏、心脏、头肾、鳃丝、脑和眼等10种组织以及Ⅱ—Ⅴ期精巢中Dmrt1基因表达。结果表明:胡子鲇Dmrt1基因cDNA全长为1417 bp,其中5′非编码区(5′-UTR)为35 bp,3′非编码区(3′-UTR)为516 bp,开放阅读框(ORF)包含864 bp,编码287个氨基酸(aa),预测所编码DMRT1为主要位于细胞核内的不稳定性亲水蛋白。氨基酸序列比对显示,胡子鲇DMRT1与已公布的非洲胡子鲇、蟾胡子鲇、黄颡鱼等鲇形目鱼类的相似性为83.3%—96.1%。胡子鲇DMRT1中具有DMRT基因家族共有的、保守性很高的DM结构域,此结构域具有典型的"C2H2C4"锌指结构,与上述鲇形目鱼类的相似性达100%,与斑马鱼、青鳉、虹鳟等鱼类的相似性为91.9%—97.3%,而与鸡、鼠、猪人等的相似性达80%以上。组织表达显示,胡子鲇Dmrt1基因仅在精巢中表达,且Ⅱ期精巢(即精子发生期)中Dmrt1基因表达量显著高于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期精巢(P<0.05),而卵巢及其他8种组织中均无表达,表明Dmrt1是胡子鲇精巢特异性表达基因,可能与胡子鲇的雄性性别决定、精子发生及精巢发育密切相关。     

斜带石斑鱼2种胰脂肪酶基因全长cDNA序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肝胰脏中胆盐活化的胰脂肪酶(bile salt-activated lipase,BSAL)和依赖于辅酶的胰脂肪酶(colipase-dependent pancreatic lipase,PL)基因的全长cDNA序列.BSAL基因全长cDNA序列1 796 bp,编码558个氨基酸,该蛋白序列含有BSAL的全部特征结构区,与其他脊椎动物BSAL的氨基酸序列同源性为49.9%～57.3%.PL基因的全长cDNA序列1 503bp,编码465个氨基酸,该蛋白序列含有PL全部的特征结构区,与其它脊椎动物PL的氨基酸同源性为49.1%～73.9%.系统树分析表明,斜带石斑鱼BSAL和PL与其它物种BSAL、PL和胰脂肪酶相关蛋白(PL-RP)聚于进化树的两个不同分支,属于2种不同的胰脂肪酶.结果证实,在同一鱼类体内也存在BSAL和PL两种胰脂肪酶基因.