赤霉属真菌诱导龙血竭形成的HPLC指纹图谱

龙血竭为百合科植物龙血树所产的树脂类药材,常常因树干部位受损伤后,经微生物侵染并分泌树脂,经提而成。本研究以活性菌株诱导所得龙血竭药材为研究对象,采用HPLC指纹图谱与对照药材相比较,为其质量控制提供评价及分析方法。采用ZORBAX SB-C18色谱柱（5μm,4.6mm×250mm）,流动相A为30%乙腈+0.3%乙酸,流动相B为100%乙腈,梯度洗脱,流速1.0mL/min,检测波长278nm与309nm,柱温25℃。结果发现,各龙血竭样品指纹图谱与对照样品相似度高,确定14个共有峰,并通过对照指认了7,4’-二羟基黄酮、龙血素A、龙血素B和白藜芦醇共4个特征性化学成分。本研究发现活性真菌菌株诱导产物可作为天然龙血竭的替代品,诱导药材质量佳,诱导效果好。     

发酵生产龙血竭中龙血素A和B的分析

以高效液相色谱法,检测血竭诱导菌在不同发酵时间下发酵龙血树干粉和龙血树愈伤组织的产物中龙血素A和龙血素B的含量。干粉发酵产物中,龙血素A的含量大于愈伤组织发酵产物中的含量,并且在第四周时达到最大值0.253 mg/g;龙血素B在第三周时达最大值0.519 mg/g。愈伤组织发酵产物也含有少量的龙血素A和龙血素B。虽然发酵产物中的龙血素B远远高于龙血树根、茎、叶中的含量,但还是低于0.4%的质量标准,因此不能应用于生产。     

龙血树真菌群及其对血竭形成的影响

从柬埔寨龙血树（Ｄｒａｃａｅｎａｃｏｃｈｉｎｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）茎杆中分离到３０３株真菌,其中镰刀菌属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）菌株占总分离频率的５２％,其次是短梗霉（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）和枝孢霉（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）。通过活体接种对血竭产生的影响试验表明,对血竭形成起重要作用的真菌主要是禾谷镰刀菌龙血树变种（Ｆ．ｇｒａｍｉｎｕｍｖａｒ．ｄｒａｃａｅｎａ）等４株红色镰刀菌,可使血竭形成量提高６６％－１２０％。     

龙血竭提取物有效成分剑叶龙血素A小鼠药动学研究

目的:选取中药广西龙血竭提取物(EDB)中有效成分之一的剑叶龙血素A(2,6-三甲氧基-4'-羟基二氢查耳酮)作为考察对象,研究其药动学规律,对龙血竭临床用药具有一定的指导意义.方法:建立实验小鼠血浆中剑叶龙血素A含量的高效液相色谱测定方法,测定给药后不同时间点血浆中剑叶龙血素A的浓度.通过药动学软件3P87进行数据处理,得出剑叶龙血素A的相关药动学参数.结果:剑叶龙血素A血药浓度高效液相色谱测定方法的线性范围为50-500ng/ml,高中低三种浓度回收率分别是114.80±2.86、103.60±4.38、101.80±2.12,最小检测浓度为10ng/ml,日内差为1.28%、日间差为2.26%、精密度(RSD)小于3%;剑叶龙血素A的药动学参数是:T(peak)为77.73min、C(max)为224.99ng/ml、T1/2Ke为72.91 min、T1/2Ka为40.94min、V/F(C)为1.019(mg/kg)/(ng/ml)、AUC为49553.47(ng/ml)*min.结论:建立了小鼠血浆中剑叶龙血素A高效液相色谱测定方法;EDB口服后剑叶龙血素A药动学为一室模型,有较大的吸收利用率,其消除半衰期为吸收半衰期的1.78倍,是吸收比消除快的药物.     

广西龙血竭中几种化学成分对血小板聚集影响的初步研究

从广西龙血竭的氯仿提取部位中得到3种化合物,经IR、1H NMR 13C NMR、MS等现代波谱技术分别鉴定为3,4'-二羟基-5-甲氧基二苯乙烯、剑叶龙血素A、龙血素B,本研究还观察了上述化合物对健康志愿者血小板聚集的影响,发现均对体外ADP诱导的血小板聚集有一定的抑制作用.     

国产血竭与禾谷镰刀菌

血竭是我国传统中药。它始载于南北朝时代的（雷公炮炙论）,迄今已有1500余年的应用历史。由于它具有行瘀止痛、止血、生肌、敛疮之功效,主要用于外伤出血,溃疡不敛,跌打损伤,瘀滞作痛等症,据统计,全国中成药产品中含血竭者计有膏、丹、散、片及气雾剂等共十四种剂型60多个品种。例如：七里散、跌打丸、再造丸、狗皮育、阿魏化痞育等。中药血竭的基源来自于百合科、棕相科、豆科和大教科等4科5属的17种植物不同部位的树脂。但是长期以来,国内和国际币场上血竭主要来源于棕润科黄藤属和百合科龙血树属植物的树脂。如“皇冠牌”和“手…     

血竭及其成分龙血素B对背根神经节细胞河豚毒素敏感型钠通道电流的影响

应用全细胞膜片钳技术在急性分离的大鼠背根神经节细胞上观察血竭及其成分龙血素B对河豚毒素敏感型电压门控性钠通道电流的影响. 结果发现, 血竭和龙血素B对河豚毒素敏感型钠通道电流峰值均有浓度依赖的抑制作用, 高浓度的血竭(0.05%)和龙血素B(0.02 mmol/L)使河豚毒素敏感型钠通道电流峰值偏移, 并电压依赖性地影响通道的激活和失活过程. 以上结果表明, 血竭对河豚毒素敏感型钠通道电流的影响主要是其成分龙血素B作用的结果. 血竭的镇痛作用可能部分是通过其成分龙血素B直接干预初级感觉神经元电压门控性钠通道, 阻碍痛觉信息传入而产生的.     

甘草药材HPLC指纹图谱研究

研究用高效液相色谱法建立甘草药材指纹图谱的分析方法。采用Symmrtry shield RP18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇和水为流动相,梯度洗脱,流速1 mL/min,柱温25℃,检测波长254 nm。用上述方法确定了10批不同产地甘草药材的24个共有峰,建立了甘草药材指纹图谱的分析方法,该方法精密度、稳定性、重复性均较好,为甘草药材的质量控制标准提供了参考。     

肿节风药材HPLC指纹图谱研究

采用反相高效液相色谱法建立了肿节风药材的指纹图谱,色谱柱为Hypersil C18(4.6 mm × 250 mm,5 μm),以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行二元梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温35 ℃,检测波长300 nm.对10批不同产地的肿节风药材进行了检测,并应用"中药色谱指纹图谱相似度评价软件"生成了共有模式色谱图,共有16个色谱峰,各色谱峰分离情况良好.精密度、重复性和稳定性试验中各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3%,符合指纹图谱要求.该方法简便,可靠,精密度、稳定性和重复性良好,可用于肿节风药材的质量评价.用该方法比较了肿节风药材不同部位指纹图谱的差异,为最佳用药部位的确定提供了理论依据.     

生产真菌蛋白的镰刀菌的研究——营养成份和摇瓶发酵条件的试验

对从3136株镰刀菌中分离筛选的产真菌蛋白的镰刀菌221,进行了营养需求和摇瓶条件试验。分别以9种碳源、16种氮源、3种无机元素、4种微量元素、4种生长因子进行了单因子和复因子试验。试验结果提出:镰刀菌221菌株的最佳培养基组份为(％):玉米淀粉3;(NH_4)_2SO_4 0.6;KH_2PO_4 0.3;MgSO_4 0.05;CaCO_3 0.5。发酵条件实验表明,最适装液量为250ml三角瓶装60ml发酵液;初始pH5.5;最适培养温度28℃;培养时间为48h。最终221菌株的菌体得率为51.00％,菌体蛋白含量为40.50％。     

太子参商品药材及其四倍体植株块根的高效液相指纹图谱

对不同产地太子参〔Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax〕商品药材及其四倍体植株的块根进行了高效液相指纹图谱分析。结果表明,10个批次的不同产地太子参商品药材与经选育获得的6个株系太子参同源四倍体植株块根的HPLC-UV指纹图谱相似度较高,均在0.9以上。选取15个特征峰并大致判断其峰位和比例关系,构成太子参特有的HPLC色谱指纹图谱,为太子参药材鉴别、品质评价及优良品种的选育提供可靠依据。     

白刺花中3种生物碱的含量及HPLC指纹图谱

为建立白刺花高效液相指纹图谱,并测定白刺花不同部位(根、茎、叶)苦参碱、槐果碱和氧化苦参碱的含量。实验采用AgilentTC-C₁₈(2)色谱柱(250×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.09%三乙胺水溶液(4∶96,磷酸调pH3.5)为流动相,流速为1.0 mL/min,紫外检测波长205 nm,柱温35℃。建立了白刺花的高效液相指纹图谱,确定了14个共有峰,样品的相似度在0.9以上。在该色谱条件下,各成分有较好的分离度,苦参碱、槐果碱和氧化苦参碱分别在6.34～101.5、6.47～103.5、8.38～100.5μg/mL范围内呈良好的线性关系(r>0.999)。用该方法测得白刺花根中苦参碱、槐果碱、氧化苦参碱的平均含量分别为8.204 8、1.237 1、66.147 6 mg/g;茎中分别为4.246 3、1.549 6、25.035 1 mg/g;叶中分别为9.314 8、6.947 4、1.573 4 mg/g。该方法简单、准确,可用于白刺花的质量控制。     

白芷药材水提液指纹图谱的研究

采用高效液相色谱法建立了白芷水提液指纹图谱,色谱柱为Lichrospher 5-C18 (250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-水为流动相进行二元梯度洗脱,柱温30℃,流速为1 mL/min,检测波长为254 nm.对12批不同产地的白芷药材进行了检测,共发现13个共有色谱峰,各色谱峰分离情况良好.精密度、重复性和稳定性试验中各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3％,符合指纹图谱要求.该方法简便、可靠,精密度、稳定性和重复性良好,可用于白芷药材的质量评价.     

不同产地茅苍术水溶性成分的HPLC指纹图谱研究

采用HPLC-ELSD法建立了茅苍术[Atractylodes lancea(Thunb.)DC.]水溶性成分的指纹图谱,并对不同产地野生与栽培茅苍术水溶性成分的指纹图谱进行了比较分析.结果表明,采用HPLC-ELSD法获得的茅苍术水溶性成分指纹图谱稳定、可靠、重复性好;供试茅苍术水溶性成分的保留时间一般在65 min之内,共有16个典型的共有色谱峰;供试茅苍术样品的指纹图谱与对照模式色谱图的相似度较高,说明该指纹图谱可作为茅苍术水溶性化学成分的特征指纹图谱.江苏产野生与栽培茅苍术水溶性成分的化学组成基本一致,以倍半萜苷类为主,主要成分均为苍术苷A;湖北产野生茅苍术水溶性成分的倍半萜苷类总含量较高,但主要成分不是苍术苷A.     

蛇足石杉产石杉碱甲内生真菌的分离鉴定

从9月份采集的野生药用植物蛇足石杉(Huperzia serrata)的茎、叶中分离纯化得到15株内生真菌,将上述内生真菌进行液体培养后,通过薄层层析法(TLC)和高效液相法(HPLC)对其代谢产物进行检测,结果表明菌株WX13产石杉碱甲(Huperzine A,HupA)。运用形态和培养特性观察,初步确定菌株WX13属于镰刀菌属(Fu-sarium sp.)。     

红豆杉内生真菌中巴卡亭Ⅲ产生菌的筛选及培养基的初步优化

目的:筛选出产巴卡亭Ⅲ的红豆杉内生真菌,为抗癌药物紫杉醇提供一个新的来源。方法:从云南红豆杉树皮中分离纯化出内生真菌,对其进行液体发酵培养,过滤,收集菌丝体并破碎,用二氯甲烷萃取,萃取液进行薄层层析,与巴卡亭Ⅲ标准品有相同比移值的样品再利用高效液型色谱与标样进行比照,进而筛选出产巴卡亭Ⅲ的内生真菌。同时以发酵培养基基础,对筛选出的真菌进行碳源和氮源的优化。并在此基础上探讨几种常见的紫杉烷类化合物代谢诱导剂乙酸钠、苯甲酸钠、苯丙氨酸和亮氨酸的浓度对巴卡亭Ⅲ积累的影响。结果:得到一株产巴卡亭Ⅲ的内生真菌NSZJ043,该菌株易培养,生长迅速,经鉴定属于曲霉属。NsZJ043产巴卡亭Ⅲ的培养条件的初步优化结果表明:最适碳源、氮源分别是蔗糖和蛋白胨;在含20g/L蔗糖、1．5g/L蛋白胨、0．1 mmol/L乙酸钠、0．01mmol/L苯甲酸钠的优化培养基中培养8d,巴卡亭Ⅲ含量为34．6μg/L。结论:筛选出一株产巴卡亭Ⅲ的内生真菌,其具有优良的发酵特性,巴卡亭Ⅲ前体物质苯甲酸钠和乙酸钠对巴卡亭Ⅲ的合成有促进作用;苯丙氨酸和亮氨酸对其含量影响不显著,优化后NSZJ043产巴卡亭Ⅲ含量有较大的提高。     

不同产地怀牛膝β-蜕皮甾酮含量测定及指纹图谱研究

建立怀牛膝中β-蜕皮甾酮的HPLC含量测定和指纹图谱方法,比较不同产地牛膝的质量差异。采用Waters SunFire C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇和水为流动相,进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长250 nm。β-蜕皮甾酮在0.26μg～2.60μg线性关系良好(r=0.9994),平均回收率为100.29%(RSD=2.42%,n=6);建立了怀牛膝药材的HPLC指纹图谱,标定了怀牛膝药材中7个共有峰,并对21个不同产地的牛膝药材进行了测定。该方法简便、准确、重现性好,可为怀牛膝质量控制和道地性研究提供依据。     

不同产地南方红豆杉枝叶的紫杉醇含量及其指纹图谱的比较分析

采用HPLC法对来源于6个产地(陕西周至和汉中;甘肃天水;安徽胡乐、聂家山和仙寓山)的12份野生南方红豆杉[ Taxus chinensis var.mairei( Lemée et Lévl.) Cheng et L.K.Fu]枝叶中的紫杉醇含量进行了比较分析,并对不同产地南方红豆杉指纹图谱的相似度进行了比较和特征指纹图谱的构建.结果表明:不同产地南方红豆杉枝叶中紫杉醇的含量有明显差异,来源于陕西和甘肃的枝叶样品中紫杉醇含量明显高于来源于安徽的样品,以产自陕西周至的枝叶样品中紫杉醇含量最高(0.019 3 mg·g-1).各样品的指纹图谱均有12个共有峰,其中9号共有峰的保留时间(32.75 min)与紫杉醇标准品一致,被确定为南方红豆杉指纹图谱的参照峰(s).各共有峰相对保留时间的RSD值均低于1％,但相对峰面积的RSD值均高于40％,说明各样品共有峰的保留时间稳定,但相对含量差异较大.除来源于安徽聂家山的2个样品外,其他样品的相似度值均在0.8以上,说明各样品间指纹图谱的相似度较高.根据12个样品的指纹图谱建立了南方红豆杉枝叶的特征指纹图谱,可用于南方红豆杉的鉴定及质量控制.由测定结果推测:不同产地南方红豆杉枝叶中紫杉醇含量的差异可能与生长环境的差异有关.     

抗菌肽Cecropin-XJ发酵产物指纹图谱及活性检测

[目的]运用HPLC初步建立抗菌肽Cecropin-XJ发酵产物指纹图谱的测定方法,将抗菌肽发酵产物进行定性及定量分析。[方法]将基因工程菌扩大培养经纯化后得发酵产物并采用高效液相色谱法测定,Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈(A)-三氟乙酸(B)梯度洗脱,检测波长254 nm,柱温25℃,流速1 mL/min,对方法进行精密度、重复性考察,绘制标准曲线估算抗菌肽浓度,以及将色谱结果与抑菌圈大小对比。[结果]建立了抗菌肽发酵产物的HPLC指纹图谱,获得了8个共有峰,8个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均<3%。通过标准曲线y=2E+07x-3E+06,R^(2)=0.994 7,得抗菌肽浓度约0.297 mg/mL。通过测量抑菌圈大小,表明抗菌肽样品活性较高。在一定范围内,各批次发酵产物抑菌圈大小与相应HPLC特征峰峰面积成正比。[结论]11批样品中共有的8个峰作为指纹图谱的共有峰,峰总面积大于总峰面积的90%,8个共有峰的相对保留时间及相对峰面积的RSD均<3%。抗菌肽浓度约0.297 mg/mL。实验结果说明抑菌圈大小与对应特征峰面积成正相关,表明特征峰出峰位置所示物质即为抗菌肽。