RNAi技术在昆虫基因组学研究及其生物防控中的研究进展

RNAi技术是通过将双链RNA（dsRNA）导入宿主细胞,沉默相关基因进而干扰宿主生长发育的一项技术,广泛应用于昆虫的生物防控。近年来,基于RNAi开展昆虫的防控技术研究中发现RNAi的效率受到多方面因素的影响,其中dsRNA的导入途径是关键的影响因素。本文总结了显微注射法、电穿孔介导法、饲喂法、转基因法、纳米载体介导法等5种方法在昆虫的基因组学研究和RNAi生物防控中的应用效果,比较了不同方案的优缺点,以期为昆虫的RNAi应用研究和生物防控技术提供参考。     

昆虫RNAi技术及其应用

RNAi是近几年发展起来的抑制基因表达的新技术。部分昆虫存在RNAi信号的系统性传播现象,可以将dsRNA直接注射进昆虫的卵、血腔或局部组织,引发远距离靶基因的特异性沉默,建立起了Embryo RNAi,Larval RNAi,Adult RNAi,Parental RNAi,Feeding RNAi和基于转基因技术的可遗传RNAi等昆虫RNAi技术,使RNAi迅速成为了研究昆虫尤其是非模式昆虫基因功能的主要方法。文章拟就RNAi的系统性、昆虫RNAi技术及其应用进行综述。     

昆虫RNAi技术与方法

RNAi技术已在昆虫基因功能研究中取得了广泛的应用。本文主要从dsRNA的设计、导入方法及RNAi结果分析方面作了概述,并对实验过程中存在的一些关键问题如RNAi特异性沉默,dsRNA导入方法的选择及不同昆虫RNAi多样性方面进行了讨论。     

二化螟碱性神经酰胺酶和中性鞘磷脂酶基因RNA干扰技术体系的优化

【目的】比较不同方法以及不同靶标基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)效率,建立并优化二化螟Chilo suppressalis碱性神经酰胺酶saCER和中性鞘磷脂酶snSMase基因的RNAi的技术体系。【方法】通过培养液浸泡法将果蝇Drosophila daCER基因的dsRNA导入果蝇S2细胞内;分别通过显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法将体外合成的二化螟saCER和snSMase基因的特异性双链RNA(dsRNA)导入二化螟3龄(注射法)和2龄(喂食法)幼虫体内,之后利用qPCR测定靶标基因的mRNA表达水平,比较不同方法对不同基因的RNA干扰效率。【结果】将果蝇S2细胞浸泡在浓度为15 ng/μL的含daCER dsRNA细胞培养液中培养72 h后,daCER基因的表达水平下降了约84%。dsRNA (5 000 ng/μL)注射二化螟3龄幼虫60 h后对saCER基因的干扰效率达到最高(41%),dsRNA (2 500 ng/μL)注射48 h后对snSMase基因的干扰效率最高(47%);给二化螟2龄幼虫喂食dsRNA(48μg/d)后,分别在第7天和第8天对saCER(32%)和snSMase(52%)基因达到最大干扰效率。对于aCER基因,果蝇S2细胞浸泡法与二化螟注射法和喂食法相比,干扰效率差异极其显著;使用相同方法,对saCER基因和snSMase基因的干扰效率无显著差异;对于二化螟的同一基因(saCER或者snSMase),注射法与荧光纳米粒子喂食法之间干扰效率也无显著性差异。【结论】碱性神经酰胺酶基因和中性鞘磷脂酶基因对导入dsRNA进行RNAi的方法较敏感,本研究建立并优化的显微注射法和荧光纳米粒子介导喂食法RNAi技术体系在鞘脂质代谢酶基因功能的基础研究中具有可行性。注射法和喂食法对二化螟幼虫aCER基因的干扰效率远低于浸泡法对果蝇S2细胞中这一基因的干扰效率,进一步证实二化螟血淋巴中的RNA酶对dsRNA的快速降解以及中肠围食膜的阻隔很大程度上削减了dsRNA进入二化螟细胞内发挥干扰作用。     

利用RNAi技术沉默小菜蛾类钙粘蛋白基因

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种调控基因表达的方法, 其通过体外合成一段与内源靶基因同源的双链RNA（dsRNA）或siRNA, 导入生物体内, 使内源靶基因中同源mRNA降解, 从而达到阻抑基因表达的目的。类钙粘蛋白（cadherin-like protein）是位于昆虫中肠刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles, BBMV)上与钙粘蛋白(cadherin)结构相似的物质, 是多种昆虫体内Bt杀虫蛋白的受体。本研究利用基因特异引物通过RT-PCR扩增了小菜蛾类钙粘蛋白基因的2个片段（CAD1和CAD2）, 合成相对应的双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA）; 并将dsRNA通过显微注射导入小菜蛾3龄幼虫体内, 测定了不同靶位点、不同剂量、不同检测时间对目的基因mRNA表达量的影响。结果表明: 将70 nL CAD1对应的dsRNA注射到幼虫体内48 h后, 基因表达量显著下降, 72 h后恢复。免疫印迹检测结果表明, 类钙粘蛋白在注射dsRNA 48 h后幼虫BBMV中的含量明显下降。本实验成功实现了小菜蛾类钙粘蛋白基因的沉默, 该体系的成功建立为利用RNAi技术分析小菜蛾及其他鳞翅目昆虫基因的功能提供了参考。     

VIGS技术在昆虫基因功能研究中的应用

RNAi作为一种基因沉默的分子生物学技术,广泛应用于生物基因功能研究.在昆虫RNAi研究中,病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术是一种将dsRNA导入昆虫体内的独特策略.目前,这种方法在半翅目和鳞翅目昆虫的研究中有诸多报道.通过携带靶标昆虫基因片段的重组病毒载体侵染寄主植物,病毒在复制过程中形成dsRNA.实验昆虫取食被侵染的寄主植物后会摄入大量的dsRNA,从而达到dsRNA导入的目的.与其它dsRNA导入方法相比,VIGS技术具有高效、高通量、昆虫接受度高等优势.本文综合分析了 VIGS技术的作用机理、应用研究、影响效率的因素及其优缺点,将来应围绕这些问题进一步深化该技术在昆虫学研究中的应用.     

Q型烟粉虱UDP-糖基转移酶UGT354A1基因克隆及其在噻虫嗪抗性中的作用

【目的】UDP-糖基转移酶（UGTs）是昆虫主要的Ⅱ期解毒酶,可能参与昆虫抗药性的形成。本研究旨在探究Q型烟粉虱中UGT基因是否参与其对噻虫嗪的抗药性。【方法】依据烟粉虱基因组数据库设计引物,克隆其UGT354A1基因的全长序列;采用qRT-PCR技术检测UGT354A1基因在烟粉虱不同发育阶段、不同组织部位以及抗敏品系中的表达量;通过RNA干扰试验,验证UGT354A1基因在烟粉虱噻虫嗪抗性中的作用。【结果】序列生物信息学分析发现,UGT354A1基因属于典型的昆虫UGTs,包括两个糖基供体（DBR1和DBR2）和一个保守特征性基序。qRT-PCR结果显示,UGT354A1基因在噻虫嗪抗性品系（THQR）中的表达量为敏感品系（THQS）的2.60倍,且噻虫嗪可显著诱导该基因的表达。在不同发育阶段和组织部位中,发现UGT354A1基因在烟粉虱若虫和成虫阶段及头部和胸部表达丰富。RNAi后,沉默UGT354A1基因能够显著增加噻虫嗪对Q型烟粉虱的毒杀作用。【结论】UGT354A1基因在Q型烟粉虱中对噻虫嗪具有重要的解毒作用,可能参与了抗性的形成。     

不同RNAi方法对飞蝗触角高表达基因沉默效率的比较

【目的】RNAi技术在研究飞蝗功能基因组学方面已经日趋成熟,飞蝗触角中富含有丰富的气味结合蛋白、转运蛋白以及气味降解酶等,这些蛋白在昆虫嗅觉信号传导中发挥着重要的作用,但是关于高效降解这些基因的相关RNAi方法还未知,因此本文通过分析不同RNAi方法对飞蝗触角高表达基因的沉默效率差异变化,以此探索一种高效降解飞蝗触角高表达基因的方法,为后续研究基因功能提供理论依据与技术指导,为从飞蝗嗅觉机制方向设计防控蝗灾的分子靶标奠定基础。【方法】以Lm CYP3117C1基因为目标基因,飞蝗为实验材料,选取飞蝗5龄若虫解剖触角、下颚须、翅、跗足、中肠、马氏管6个组织部位,利用实时荧光定量PCR技术分析基因不同组织部位的表达特异性。用不同溶剂溶解ds RNA(DEPC水,丙酮和DEPC水(1︰1)混合溶剂,0.1%Triton X-100),分别采用注射法(触角窝注射和腹部注射),浸泡法和涂抹法3种方法干扰靶标基因,利用实时荧光定量PCR技术分析基因表达抑制情况,研究不同RNAi方法对基因表达量变化的影响。【结果】Lm CYP3117C1基因在飞蝗若虫6个组织部位均有表达,在触角的表达量最高,分别是下颚须、翅、跗足、中肠、马氏管的3.78倍、2.10倍、10.84倍、363.48倍、365.16倍。通过在两边的触角窝注射ds CYP3117C1,24 h后飞蝗雌雄虫触角Lm CYP3117C1表达量显著降低,雌虫和雄虫沉默效率分别为76.84%和87.51%,但在其他组织部位(下颚须、翅、跗足、其余整虫)基因表达量没有发生显著变化;飞蝗腹部注射ds CYP3117C1,24 h后雌雄虫触角的基因表达水平均发生显著降低,其中雌虫触角沉默效率达68.60%,雄虫沉默效率达61.10%,另外,飞蝗雌虫跗足Lm CYP3117C1基因表达量也发生显著降低,但下颚须、翅和其余整虫没有明显变化;飞蝗雄虫下颚须,其余整虫Lm CYP3117C1基因表达有显著降低,翅和跗足没有发生明显变化;将飞蝗触角浸泡于溶于不同溶剂的ds CYP3117C1溶液中(DEPC水、丙酮和DEPC水(1∶1)混合溶剂、含0.1%Triton X-100的DEPC水),分别浸泡1,3,5 min,24 h后检测雌雄虫触角Lm CYP3117C1基因表达情况,结果显示没有发生明显变化;将ds CYP3117C1分别溶于DEPC水和含0.1%Triton X-100的DEPC水中涂抹飞蝗触角,24 h后发现飞蝗雌雄虫触角Lm CYP3117C1基因表达水平无显著变化。【结论】飞蝗触角浸泡法和涂抹法干扰Lm CYP3117C1没有显著效果,腹部注射法对飞蝗触角Lm CYP3117C1的沉默效率较低,触角窝注射法可以高效降解Lm CYP3117C1,可作为飞蝗触角高表达基因RNAi的主要干扰方法。     

基于工程菌高效合成靶向昆虫基因的dsRNA的方法

外源或内源双链RNA(dsRNA)可以干扰昆虫基因的表达。目前,利用RNA干扰(RNAi)技术防治农业害虫已经取得了一定进展,但高昂的dsRNA合成成本是RNAi技术在田间应用的主要限制因素。本方法利用L4440质粒和大肠杆菌HT115(DE3)菌株,建立了一种经济、高效的昆虫靶标基因dsRNA合成方法。与商业化的dsRNA合成试剂盒相比,工程菌合成dsRNA的方法大幅降低了dsRNA的合成成本。本方法将为大规模昆虫基因功能解析和RNAi制剂的田间应用提供可能,有望促进以RNAi为核心的害虫防治技术的实践和发展。     

RNAi和取食不同品种水稻后白背飞虱多铜氧化酶4基因的表达差异及生物学效应

【目的】分析RNAi及取食不同品种水稻后白背飞虱Sogatella furcifera多铜氧化酶4(multicopper oxidase 4, MCO4)基因的表达差异和生物学效应,以期为该基因的功能研究提供理论依据。【方法】通过生物信息学技术方法分析白背飞虱MCO4基因的核苷酸和氨基酸序列;利用RNAi技术沉默白背飞虱3龄若虫的MCO4基因,检测显微注射法和饲喂法的沉默效率,研究该基因被干扰后对白背飞虱3龄若虫存活率的影响;白背飞虱成虫取食不同抗性水稻品种24 h后,采用RT-qPCR检测其体内MCO4基因表达量的变化,并统计其体重。【结果】白背飞虱MCO4基因的核苷酸序列全长为2 166 bp,编码721个氨基酸。显微注射法进行MCO4基因的RNAi可成功沉默白背飞虱的MCO4基因,且沉默效率远高于饲喂法。MCO4基因被RNAi沉默后白背飞虱3龄若虫存活率显著低于正常若虫的。与取食水稻感虫品种TN1相比,取食水稻抗虫品种IR26的成虫MCO4基因表达量显著增加,且成虫体重显著降低。【结论】显微注射法可以更好地干扰白背飞虱MC04基因的表达。沉默MCO4基因对白背飞虱3龄若虫的存活率有显著影响,我们推测MCO4基因在白背飞虱取食水稻中具有重要的作用。     

Recent advances in the study of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus replication and pathogenesis

It has now been over twenty years since a novel herpesviral genome was identified in Kaposi's sarcoma biopsies. Since then, the cumulative research effort by molecular biologists, virologists, clinicians, and epidemiologists alike has led to the extensive characterization of this tumor virus, Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus(KSHV; also known as human herpesvirus 8(HHV-8)), and its associated diseases. Here we review the current knowledge of KSHV biology and pathogenesis, with a particular emphasis on new and exciting advances in the field of epigenetics. We also discuss the development and practicality of various cell culture and animal model systems to study KSHV replication and pathogenesis.     

The structure, reproduction and taxonomy of Vidalia and Osmundaria (Rhodophyta, Rhodomelaceae)

Comprises species occurring mostly in subtidal habitats in tropical, subtropical and warm-temperate areas of the world. An analysis of the type species, V. spiralis (Sonder) Lamouroux ex J. Agardh, a species from Australia, establishes basic characters for distinguishing species in the genus. These characters are (1) branching patterns of thalli, (2) flat blades that may be spiralled on their axis, (3) width of the blade, (4) primary or secondary derivation of sterile and fertile branchlets and (5) position of sterile and fertile branchlets on the thalli. Application of the latter two characters provides an important basic method for separation of species into three major groups. Osmundaria , a genus known only in southern Australia, was studied in relation to Vidalia , and its separation from the Vidalia assemblage is not accepted. Species of Vidalia therefore are transferred to the older genus name, Osmundaria. Two new species, Osmundaria papenfussii and Osmundaria oliveae are described from Natal. Confusion in the usage of the epithet, Vidalia fimbriala Brown ex Turner has been clarified, and Vidalia gregaria Falkenberg, described as an epiphyte on Osmundaria pro/ifera Lamouroux, is revealed to be young branches of the host, Osmundaria prolifera.     

New or rare chromosome counts in Artemisia L. (Asteraceae, Anthemideae) and related genera from Kazakhstan

Fifteen chromosome counts of six Artemisia taxa and one species of each of the genera Brachanthemum, Hippolytia, Kaschgaria, Lepidolopsis and Turaniphytum are reported from Kazakhstan. Three of them are new reports, two are not consistent with previous counts and the remainder are confirmations of very scarce (one to four) earlier records. All the populations studied have the same basic chromosome number, x = 9, with ploidy levels ranging from 2x to 6x. Some correlations between ploidy level, morphological characters and distribution are noted.     

肝癌中HBV和HCV基因和抗原的分布及意义

采用原位分子杂交方法检测HCV RNA及HBV X基因;采用免疫组织化学方法研究HCV核心抗原,非结构区C33c抗原及HBxAg在肝细胞肝癌中的定位及分布.结果表明(1)HCV RNA、HBV X基因在肝细胞肝癌组织检出率分别为40%(55/136)和82%(112/136).HCV RNA定位于癌细胞的胞浆内,阳性细胞呈散在、灶状及弥漫分布三种形式;HBV X基因在肝癌细胞中的分布呈胞浆型、核型及核浆型,阳性细胞也呈上述三种分布形式;(2)HCV C33c抗原、核心抗原在肝细胞肝癌中的阳性率为81%(133/164)及86%(141/164).C33c抗原定位于癌细胞及肝细胞的胞浆内;核心抗原既定位于癌细胞核中,又可定位于胞浆中.C33c抗原阳性细胞以灶状分布为主;而核心抗原阳性细     

Selection with two alleles and complete dominance

For a plant selection model with frequency-independent viabilities, fertilities and selfing rates, it is shown that apart from global fixation, for certain parameter combinations a protected polymorphism and facultative fixation (either allele may become fixed according to initial frequencies) may both occur. Facultative fixation requires different selling rates for the dominant and recessive type. Protection of the polymorphism requires resource allocation for male and female function. In this connection the problem of purely genetically caused population extinction is discussed.
For general frequency dependence and regular segregation, the chances for establishment of a completely recessive gene are compared to those of a completely dominant gene. It is proven that the process of establishment of the recessive gene, despite a fitness advantage, may be considerably endangered by drift effects if random mating prevails. The recessive gene may reach the same effectivity in establishment as a dominant gene, only if the recessive homozygote mates exclusively with its own type during the period of establishment.