牛泡沫病毒内部启动子的克隆及功能分析

以该实验室分离并鉴定的牛泡沫病毒（ＢＦＶ３０２６）为材料,用ＰＣＲ方法首次克隆了位于ｅｎｖ基因３’端的内部启动了,经序列分析后,引入ｌｕｃ基因作瞬时分析。结果表明,该内部启动子不但基础活性高于ＬＴＲ,而且转录活怀在Ｔａｓ参与下被大大激活,其激活活性也远远高于ＬＴＲ。同源分析表明,非灵长类泡沫病毒内部启动子之间的同源性高于其与灵长类泡沫病毒内部妄动子之间的同源性。     

牛泡沫病毒反式激活因子在内部启动子上应答元件的研究

泡沫病毒的基因转录依赖至少两个不同的启动子：ＬＴＲ调节病毒结构蛋白的表达,而内部启动子（ＩＰ）则起始调节蛋白ｍＲＮＡ的转录。牛泡沫病毒（ＢＦＶ）在ｅｎｖ与３’ＬＴＲ之间有两个重叠的开放阅读框架ｏｒｆ－１和ｏｒｆ－２,分别编码ＢＦＶ ＯＲＦ－１、ＯＲＦ－２等多种调节蛋白。这此蛋白中ＢＦＶ ＯＲＦ－１为转录激活因子,称为Ｔａｓｏ Ｔａｓ对ＬＴＲ及ＩＰ均有反式激活作用。ＢＦＶ中第二类启动子ＩＰ的存在反映     

泡沫病毒基因组结构及其调节蛋白的功能

泡沫病毒（Ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓｅｓ）传统上被分为反转录病毒科的泡沫病毒亚科,按１９９１年Ｃｕｌｅｎ的分类系统,泡沫病毒属复杂反转录病毒中的一个属。对泡沫病毒的研究远滞后于其它反转录病毒,这主要是由于至今未能确定其致病性。泡沫病毒可能与神经性病变相关的...     

牛泡沫病毒长末端重复序列在大肠杆菌中的启动子功能

泡沫病毒具有复杂的基因组结构,包含典型反转录病毒共有的长末端重复序列(long terminal repeat,LTR)启动子,负责起始结构基因gag、pol、env的表达,并在env基因内部存在独有的内部启动子(internal promoter,IP)[13],用以起始下游反式作用因子Tas(在BFV中称Borf-1)的表达.有报道劳斯肉瘤病毒(rous sarcoma virus,RSV)和人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)LTR可在E.coli中起始基因表达[4,7].泡沫病毒至今未见报道.     

牛泡沫病毒两类启动子活性的比较和机制探讨

牛泡沫病毒 (Ｂｏｖｉｎｅｆｏａｍｙｖｉｒｕｓ,ＢＦＶ)属反转录病毒科泡沫病毒属。其基因组两端为长末端重复序列 (Ｌｏｎｇｔｅｒｍｉｎａｌｒｅｐｅａｔ,ＬＴＲ) ,中间部分除ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ三个结构基因外 ,还有两个重叠的读码框ＯＲＦ 1、2 ,起始于ｅｎｖ基因 3′端 ,终止于 3′ＬＴＲ ,编码Ｂｏｒｆ 1、Ｂｏｒｆ 2等多种调节蛋白[1～ 3 ] 。其中Ｂｏｒｆ 1为ＢＦＶ的反式激活因子 ,可显著激活ＢＦＶＬＴＲ启动子起始的基因表达。近年来 ,在泡沫病毒家族成员人泡沫病毒 (Ｈｕｍａｎｆｏａｍｙｖｉｒｕｓ,ＨＦＶ)和猴泡沫病毒(…     

棉花曲叶病毒反式作用因子AC2的功能初探

有关非洲木薯花叶病毒（ACMV）、番茄金色花叶病毒（TGMV）的研究表明,双生病毒编码的反式作用因子AC2反式激活病毒链基因启动子的瞬时表达。以棉花曲叶病毒（CLCuV)侵染的烟草叶片组织总的DNA为模板,通过聚合酶反应扩增CLCuV的AC2基因片段并插入克隆载体。将AC2置于CaMV35S启动子下构建了瞬时表达载体。通过基因他法将质粒载体导入烟草（Nicotiana tabacumL.)和棉花（Gossypium hirstumL.)叶片细胞中进行瞬时表达,结果表明,在反式作用因子AC2的激活下,病毒链基因启动子驱动的GUS活性明显增强,然而激活后的病毒链基因启动子的活性仍低于互补链基因方向启动子;其表达方式与互补链基因启动子相似,即在叶肉及叶脉维管组织均有较高的活性。还探讨了AC2在土壤杆菌介导的转基因植物中的表达行为。     

牛免疫缺陷病毒─BIV

牛免疫缺陷病毒─ＢＩＶ陈荷新,耿运琪,曾毅（南开大学生命科学学院３０００７１）反转录病毒（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）是一大类ＲＮＡ病毒,大致可以分为三个亚类,即致瘤病毒亚科（Ｏｎｃｏｖｉｒｉｎａｅ）、慢病毒亚科（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｉｎａｅ）和泡沫病毒亚科（...     

痘苗病毒天坛株4b启动子的转录效率

痘苗病毒天坛株４ｂ启动子的转录效率崔虹容敏清王芝山侯云德（中国预防医学科学院病毒学研究所病毒基因工程国家重点实验室,北京１０００５２）关键词痘苗病毒,４ｂ启动子痘苗病毒载体在多价基因工程疫苗的研制中十分重要,外源基因在重组痘苗中的高效表达主要依靠启...     

家蚕BmN细胞中8种启动子的活性比较及利用hr5-IE1启动子实现EGFP的稳定表达

为筛选出一个较强的启动子用于提高转座子piggyBac在家蚕Bombyx mori细胞中的转化效率,采用双荧光素酶报告基因检测（dual-luciferase reporter assay）技术比较了热激蛋白启动子（hsp70和hsp82）、家蚕肌动蛋白启动子（A3）、多聚泛素（polyubiquitin）启动子（PUB）、α微管蛋白启动子（α-tub）、丝素轻链启动子（Fib-L）、人工合成启动子3×P3及苜蓿丫纹夜蛾多角体病毒（AcNPV）增强子-启动子组合（hr5-IE1）8种启动子在家蚕细胞株BmN内的活性。结果显示hr5-IE1活性最强,A3次之,其余启动子活性均较弱。构建含有hr5-IE1启动子和piggyBac的转座酶编码区的质粒作为辅助质粒,与EGFP载体质粒一起转染家蚕细胞后,实现了EGFP基因整合到细胞基因组中。因此,今后可考虑将hr5-IE1用于家蚕细胞遗传转化的研究中,以提高细胞转化的效率。     

昆虫杆状病毒晚期启动子在大肠杆菌中启动CAT基因表达

将油桐尺蠖（Ｂｕｚｕｒａｓｕｐｐｒｅｓｓａｒｉａ）核多角体病毒晚期基因──多角体蛋白基因启动子及５′端编码区,以两种不同方式置于缺乏启动子的氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）基因上游,使其分别终止在不同翻译终止位点,其宿主菌具有明显不同的氯霉素抗性,最高达２００ｍｇ／Ｌ　ＬＢ培养基以上,表明昆虫病毒启动子能启动原核基因表达。对多角体蛋白基因启动子能在大肠杆菌中有效工作的原因进行了讨论。     

一株新的狂犬病重组痘苗病毒某些生物学性质的研究

对表达狂犬病毒糖蛋白的重组痘苗病毒ＶＶＭ１１ＫＲＧ株生物学性质进行了研究,该重组病毒的特点是：（１）糖蛋白基因插入到痘苗病毒天坛株基因组ＨｉｎｄⅢＭ片段中;（２）启动子为痘苗病毒天坛株Ｐ１１晚期启动子;（３）不含外源ｌａｃ基因。该重组病毒在ＣＶ－１细胞和鸡胚细胞上繁殖滴渡略高于另一株重组痘苗病毒ＶＶＴＫ１１ＫＲＧ,在鸡胚细胞中繁殖滴度第三天达到最高,在ＣＶ－１细胞中第二天达到最高。温度稳定性与天坛株相比没有明显改变。重组病毒在家兔皮内的毒力比亲本株（天坛株）低。间接免疫荧光和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ都证明了狂犬病毒糖蛋白有良好的表达。通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实糖蛋白基因准确地插入到ＨｉｎｄⅢＭ片段中。重组痘苗病毒启动子与部分糖蛋白基因克隆到ｐＧＥＭ３ｚｆ（－）质粒上,对该段ＤＮＡ序列分析表明不会产生移码和融合蛋白,从而为该重组病毒的使用提供了明确的基因背景资料。     

HSV-1立即早期蛋白ICP22与VP16共同参与α基因转录调控的初步分析

Ⅰ型单纯疱疹病毒（herpes simplex virus1,HSV-1）在宿主体内形成两种感染模式,不同感染模式的建立与病毒α基因的表达相关.作为病毒α基因表达产物之一的ICP22在病毒复制中发挥了多重作用,但其确切功能尚不清楚.实验利用氯霉素乙酰转移酶（chloram-phenicol acetyl transferase,CAT）报告系统发现ICP22非特异地抑制多种病毒或细胞启动子的转录启动作用,而且该抑制作用不受特定的病毒或细胞启动子上游调控元件影响.进一步的实验发现,HSV病毒蛋白VP16通过结合α4基因启动子上游特定元件解除ICP22对α4基因的转录抑制.这些结果提示,ICP22和VP16可能共同参与α基因的转录调控,从而建立HSV-1裂解性增殖或潜伏性感染.     

不同异源启动子与MDV gB启动子及其复合启动子的活性比较

为了选择适宜的启动子调控外源基因的表达,以改善马立克氏病病毒为载体的重组病毒的免疫保护力。将hCMV立即早期启动子及增强子、SV40早晚期启动子及增强子或hCMV立即早期增强子的部分序列分别与马立克氏病病毒（MDV）自身的囊膜糖蛋白B基因（gB）启动子核心部分在体外杂合,分别构建复合启动子PhCMVgB、P SVgB或PengB;将这些启动子与虫荧光素酶报告基因相连,构建表达载体。利用脂质体将以上质粒与内标质粒（pSVβLacZ）共转染鸡胚成纤维次代细胞,于转染后48h,将细胞刮下来,利用荧光素酶测定试剂盒和β半乳糖苷酶测定试剂盒分别测定转染细胞的荧光素酶和β半乳糖苷酶的活性,通过荧光素酶和β半乳糖苷酶活性的比值获得虫荧光素酶的相对活性,利用虫荧光素酶的相对活性进行启动子的活性比较。结果表明,复合启动子相对马立克氏病病毒自身的gB启动子,活性有不同程度的提高,其中复合启动子PhCMVgB的活性最高,而复合启动子PSVgB和PengB的活性相当;但与商业强启动子相比,复合启动子活性要弱一些或相当。因此,从某种意义上讲,这些复合启动子既具有gB启动子的一些特性,又有商业强启动子的一些特性,为以马立克氏病毒为载体的新兴疫苗的开发奠定了基础。     

高致病性中东呼吸综合征冠状病毒识别细胞受体分子机制的破译

冠状病毒属巢状病毒日（Order：Nidovirales）冠状病毒科（Family：Coronaviridae）冠状病毒属（Genus：Coronavirus）,为一类具囊膜的RNA病毒。     

HIV—1长末端重复序列对重组痘苗病毒表达Gag蛋白的影响

将系列缺失的ＨＩＶ１长末端重复序列（ＬＴＲ）和全长的ｇａｇＯＲＦ置于痘苗病毒载体中,经同源重组和血球吸附试验,成功地构建了６株重组痘苗病毒。免疫印迹和免疫酶试验检测均表明,６株重组病毒的Ｇａｇ蛋白表达量因ＬＴＲ不同而有明显差异,表明ＨＩＶ１的ＬＴＲ及其下游基因置于痘病毒启动子控制下,在痘苗病毒中表达时有下述特点：（１）不同的痘苗病毒启动子与全长ＬＴＲ相互作用,对ｇａｇ基因表达有显著不同的调控效果;（２）ＮＲ序列对Ｇａｇ蛋白表达没有明显影响;（３）ＥＮ序列不能被重组痘苗病毒表达系统识别;（４）ＴＡＲ序列可提高Ｇａｇ蛋白的表达量;（５）Ｕ５区及下游非翻译序列不影响Ｇａｇ蛋白的表达。     

人巨细胞病毒痘苗重组质粒在T_（32）－Istrati减毒菌苗株中的转化

人巨细胞病毒痘苗重组质粒在Ｔ_（３２）－Ｉｓｔｒａｔｉ减毒菌苗株中的转化赵庆萱（卫生部兰州生物制品研究所，兰州７３００４６）肖伟华（卫生部长春生物制品研究所，长春１３００６２）人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）痘苗重组质粒（ＰＳＣ１１－１１５）是具有强启动子的?..     

鲤鱼生长激素基因在鲫鱼中的基因转移及PCR检测

鲫鱼群体内,个体之间的生长速度差别不大,遗传保守性较强,用常规育种方法很难获得生长速度快、个体差异较大的后代。通过基因转移技术,将外源基因如鱼的生长激素基因导入鱼的受精卵中,而获得转基因鱼是钱定向育种的一条有效途径。已有报道,在虹鳟鱼生长激素cDNA上游连结一个病毒启动子构建成表达质粒,由此获得的转基因鲤鱼比对照生长速度快20％。但是未见有将鲤鱼生长激素基因导入鲫鱼受精卵的报导。我们克隆了鲤鱼生长激素基因,并用它构建了含有病毒启动子（F.1,插入0．8Kb,位于XbaI和PstI之间)的表达质粒（Fig.2,命名为pCMV－TK－CGH）。用该质粒对鲫鱼受精卵进行注射,注射了1000粒卵,获得了转基因实验鲫鱼480尾。孵化率为48％。将其中100尾幼鱼于水簇箱中进行放养。选择其中个体较大的50尾进行PCR检测。其中8条鱼的基因组DNA有0．6Kb的PCR扩增产物（Fig.3),表明其上整合有外源的鲤鱼生长激素基因,其整合率为16％。其中最大的一条体重4．2g,体和6cm,比对照（0．7g,4cm）体重增加5倍,体长增加2cm(Fig.4)。我们构建的是高效表达质粒,其上含有巨细胞病毒增强子和人单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子（属强启动子）,对鲤鱼生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因有较强的启动作用。鲤鱼和鲫鱼在分类上属同科不同属,考虑到两者生长激素基因的同源性,对转基因鲫鱼的PCR检测参照了加拿大学者Du所用引物的设计、使注射的外源基因与其本身的内源生长激素基因相区别。我们的转基因整合率（16％）与Zhang(10%)、Grass和Hackett等报道的接近。转基因鲫鱼生长速度增加的倍数（5倍）与Du等人的结果（2－6）接近。但是,这一生长速度快的优势能否遗传给后代,有待进一步观察。     

棉花曲叶病毒启动子在根癌土壤杆菌中的表达活性

棉花曲叶病毒（CLCuV)是一种单链DNA病毒,属于双生病毒亚组Ⅲ,检测了双生病毒双向启动子在根癌土壤杆菌（Agrobacterium turnefaciens(Smith et Townsend) Conn()LBA4404中的活性,研究发现在根癌土壤杆菌中CLCuV双向启动子的互补链启动子活性高于病毒链启动子,其在土壤杆菌中驱动的GUS活性为CaMV 35S启动子驱动的GUS活性的2倍,同时,通过对一系列CLCuV双向启动子的互补链5′端缺失体在土壤杆菌中的活性分析表明－287bp上游可能存在一负调控元件,该元件的缺失可使启动子活性达全长启动子的4倍之多,还讨论了CLCuV互补链启动子所亿的其他顺式元件的功能。     

昆虫杆状病毒晚期启动子在大肠杆菌中启禖AT基因表达

将油桐尺蠖核多角体病毒晚期基因－多角体蛋白基因启动子及５’端编码区,以两种不同方式置于缺乏启动子的氯霉素乙酰基转移酶（ＣＡＴ）基因上激,使其分别终止在不同翻译终止位点,其宿主菌具有明显不同的氯霉素抗性,最高达２００ｍｇ／ＬＬＢ培养基以上,表明昆虫病毒启动子能启动原核基因表达,对多角体蛋白基因启动子能在大肠杆菌中有效工作的原因进行了讨论。     

K14和CMV启动子驱动裸鼠体内HPV16 E6/E7基因表达的差异

人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）是一种无包膜的环状闭合双链DNA病毒,具有严格的嗜人组织的特性．为探讨不同启动子驱动HPV E6/E7癌蛋白在裸鼠体内不同组织的表达效率,构建了带有角蛋白(K14)启动子和带有巨细胞病毒（CMV）启动子的E6/E7腺病毒载体（pAd-K14-E6/E7和pAd-CMV-E6/E7）,pAd-K14-E6/E7和pAd-CMV-6/E7、以及作为对照的重组腺病毒空载体pAdtrack- K14和pAd-CMV同源重组后,分别在293细胞中包装,收集重组病毒Ad-K14-E6/E7 、Ad-CMV-E6/E7、Adtrack-K14和Ad-CMV,通过尾缘静脉注射到随机分组的裸鼠体内,并每d向裸鼠腹腔注射0.05 mg雌激素．采用RT-PCR和Western 免疫印迹检测不同实验组E6/E7 mRNA 和蛋白表达水平,免疫组化法检测P53和Bcl-2蛋白表达．结果显示,注射病毒Ad-K14-E6/E7（实验组1）裸鼠子宫体中E6/E7 mRNA、E6蛋白质、P53和Bcl-2蛋白高表达,而其它组织中低表达;注射病毒Ad-CMV-E6/E7（实验组2）裸鼠各组织E6/E7　mRNA、E6蛋白质、P53和Bcl-2蛋白均低表达．研究表明,在裸鼠体内角蛋白K14启动子可以调控E6/E7在子宫体中表达,CMV启动子未能诱导E6/E7在子宫体中表达．