人类特定染色体DNA文库的建立和利用

DNA文库的建立及其应用于基因定位的可能性首先在基因组较小的生物(如果蝇)中得到证实。由于近年来原位噬菌斑和克隆杂交,改进的λ克隆载体以及体外包装系统等的发展,对于具育较复杂的基因组的生物(包括哺乳动物)也进行了墓因文库的建立和筛选工作     

染色体特异DNA文库的构建与鉴定

为构建人类21号染色体特异DNA文库, 以应用于人类遗传疾病的鉴定和研究, 文章采用循环温度梯度法溶解释放微分离的人外周血细胞21号染色体DNA, 将其进行简并寡核苷酸引物PCR(Degenerate oligo nucleotide primer-PCR, DOP-PCR)扩增后, 利用100~500 bp和500~2 000 bp分段回收纯化的两种不同片段大小的DOP-PCR产物构建染色体特异DNA文库, 并分别采用荧光原位杂交(Florescence in situ hybridization, FISH)和斑点杂交对DOP-PCR产物的来源和随机取样的文库克隆进行检测以评估所构建DNA文库的特异性。结果表明: 循环温度梯度法能有效溶解释放微分离的21号染色体DNA; 通过对DOP-PCR产物的分段回收纯化和克隆, 增加了大片段DNA的连接效率; 利用FISH技术和斑点杂交双重鉴定实验证明了文库的特异性, 从而构建了21号染色体特异的DNA文库, 并建立了构建染色体特异DNA文库及检测其特异性的方法, 为21号染色相关遗传疾病的鉴定和研究奠定了基础。     

携带黄矮病抗性基因染色体DNA文库的构建

单条染色体的分离及其ＤＮＡ片段的克隆是将细胞学与现代分子生物学相结合的一项新技术。它对染色体结构和基因进化的研究、基因组物理图谱及分子标记连锁图构建等 ,特别是增加染色体某些区域的探针密度具有重要意义。２０世纪９０年代以来 ,有关植物染色体微分离及体外扩增的报道中 ,只有少数几篇是关于单条染色体的体外扩增及其克隆 ,其采用的为微细玻璃针法。在前人工作的基础上 ,我们探索了一套操作方便、容易掌握的激光微分离、微克隆技术体系。本文以中间偃麦草二体异附加系Ｚ２与普通小麦宛７１０７杂交（Ｚ２×宛７１０７）的Ｆ１ …     

小麦6B染色体微切割及其不同片段的DNA文库构建

用Nd:YAG激光微束将处于丝分裂中期的小麦(Triticum aestivum L.)6B染色体微切割为四段,并用微细玻璃针将每个片段分别回收.将分离的染色体片段DNA用Sau3A接头介导的多聚酶链式反应(LA-PCR)分别扩增.Southem杂交证明4个特定区域的DNA确实来自于小麦基因组.用一系列(42对引物)位于6B染色体上的微卫星序列对微切割的染色体片段的PCR产物进行了验证.结果表明,获得的染色体片段的PCR产物来自于小麦6B染色体.将6B染色体4个片段的第二轮PCR产物克隆到pGET-vector中,建立了4个染色体特定区域的基因组文库,命名为R1、R2、R3和R4,分别包含2.1×105、2.74×105和2.93×105个重组子克隆.每个文库均随机挑选150个克隆进行质粒的小量制备和酶切验证.结果显示;插入片段大小在300～1800之间,平均大小为820～870bp,其中43%～48%的克隆为低/单拷贝序列,42%～47%为中/高拷贝序列.本研究为详细分析植物单染色体的不同片段的分子遗传学研究提供了基础.     

小麦6B染色体微切割及其不同片段的DNA文库构建

用Nd∶YAG激光微束将处于有丝分裂中期的小麦(Triticum aestivum L.)6B染色体微切割为四段,并用微细玻璃针将每个片段分别回收。将分离的染色体片段DNA用Sau3A接头介导的多聚酶链式反应(LA-PCR)分别扩增。Southern杂交证明4个特定区域的DNA确实来自于小麦基因组。用一系列(42对引物)位于6B染色体和其他染色体上的微卫星序列对微切割的染色体片段的PCR产物进行了验证。结果表明,获得的染色体片段的PCR产物来自于小麦6B染色体。将6B染色体4个片段的第二轮PCR产物克隆到pGEMT-vector中,建立了4个染色体特定区域的基因组文库,命名为R1、R2、R3和R4,分别包含2.1×10~5、2.74×10~5、2.45×10~5和2.93×10~5个重组子克隆。每个文库均随机挑选150个克隆进行质粒的小量制备和酶切验证。结果显示:插入片段大小在300～1800 bp之间,平均大小为820～870 bp,其中43％～48％的克隆为低/单拷贝序列,42％～47％为中/高拷贝序列。本研究为详细分析植物单染色体的不同片段的分子遗传学研究提供了基础。     

刺鳅X染色体DNA文库的构建

刺鳅（Mastacembelus aculeatus）是具有明显X和Y异形性染色体分化的淡水鱼。本实验室通过显微切割（Microdissection）和兼并引物PCR（DOP-PCR）方法,从雌性刺鳅中期染色体分裂相中分离获得X染色体并扩增其DNA,利用T载体和电转化方法,建立了刺鳅X染色体DNA质粒文库。该文库插入片段的平均长度约为500bp,理论上包含X染色体98％以上的序列。当用荧光原位杂交（FISH）来验证文库的专一性时发现,在无竞争性DNA杂交条件下,整个X和Y染色体上都表现出强烈的杂交信号,并且常染色体上也出现一些随机散布信号;当含有竞争性DNA时,常染色体上的信号消失,仅性染色体上异染色质区域保留有较强信号。就此,本文对刺鳅性染色体上的序列类型进行了探讨。     

利用TLS提取染色体DNA

本文报告利用三乙醇、胺月桂基硫酸盐代替蛋白酶提取组织、细胞及外周血DNA。方法简便、快速、经济。DNA产率、纯度、分子量等标准均不低于蛋白酶水解法,可以满足基因分析的要求。     

大片段DNA插入文库的研究进展

基因组DNA大片段插入文库作为基因组学和基因克隆的技术平台,它的发展主要经历了Cosmid文加,YACs文库,BACs文库三个阶段,文中对几种文库作了简单的比较和评价,对大片段文库的应用人了比较详实的介绍。作者根据自己的建库经验,重点介绍了BAC文库的构建。     

关于细菌人工染色体(BAC)文库载体DNA制备的研究

细菌人工染色体（BAC）文库在基因组研究中起着关键作用。构建BAG文库的一个关键步骤就是BAC载体DNA的制备,制备高质量的BAC载体DNA受到包括酶切,脱磷等诸多因素的影响。以BAC载体pECBAC1为材料,分别采用限制性内切酶BamHⅠ和HK脱磷酶对其进行酶切和脱磷,并结合凝胶回收缩化技术,制备了可用于进一步构建BAC文库的线性载体DNA。并在此基础上,确定了制备BAC载体DNA的适宜条件,其中包括确定适宜限制内切酶用量及酶切时间,脱磷酶种类及浓度和凝胶回收纯化线性载体DNA等关系步骤。     

人类Y染色体DNA多态性及其应用

Y染色体的大部分区域为Y特异区,呈严格的父系遗传,因此Y染色体上的DNA多态性在人类进化、法医学等领域具有特殊的应用价值。     

人类性染色体特异ＤＮＡ对三种鱼类染色体的描绘

染色体描绘是研究基因组进化的强有力手段之一,用人Ｘ和Ｙ染色体文库特异ＤＮＡ为探针,对３种硬骨鱼类－刺鳅、黄鳝和斑马鱼的有丝分裂中期裂染色体进行了描绘研究,结果表明,在这３种鱼类的染色体组中都发现有人Ｘ染色体特DN的同源片段,它们散布在几对同源染色体中,但用人Ｙ染色体ＤＮ描绘这３种鱼类染色体时,则没有检测出可见的同源片段。同时对从低等脊椎动物到人类的Ｘ染色体进化过程进行了进一步探讨。     

分子生物学技术讲座（四）——真核基因组DNA的制备,分析及基因组DNA文库的构建

真核细胞DNA的制备通常是在有EDTA及SDS一类去污剂的存在下用蛋白酶K消化细胞后用酚抽提而实现的。用此方法得到的DNA,其大小为IOO～15Okb,恰好用于SOIJthern分析和经限制性内切酶部分消化后用人噬体载体构建基因组DNA文库。而用粘粒载体或用酵母人工染色体（YAC）载体构建基因组DNA文库则需要更大的DNA。1关于DNA的制备制备真核细胞基因组DNA的方法有许多种,但基本步骤相类似,即包括组织匀浆、细胞裂解、蛋白和RNA的去除以及用乙醇沉淀或透析等方法除去残存的其它物质。方法的选择主要根据样品的类型以及所制备的DN…     

多枝赖草基因组可转化人工染色体（TAC）文库的构建和鉴定

为了克隆和转化多枝赖草（Leymus multicaulis）耐黄矮病、耐蚜虫、耐干旱、耐盐碱等抗逆性基因,利用脉冲电泳分离纯化2Mb以上核DNA,酶切后回收10～200kbDNA片段按大小分5组与TAC载体连接后电转化导入细菌DH10B,在卡那霉素和蔗糖选择压下均有阳性克隆．用两种TAC载体pYLTAC17和pYLTAC747H／sacB分别构建了文库I和II,约16．5和23．6万个克隆,估计覆盖3～5倍多枝赖草基因组大小．文库以混合克隆形式保存在12×2块深孔96孔板中,每孔1．2mL菌液中含300～600个克隆,40多万个克隆转存到3块384孔板,留24个孔存叶绿体和线粒体DNA探针菌液,可用于后续文库鉴定．此外,从文库I和II分别挑取2501和2890个单克隆存于14块384孔板中．17块384孔板都用GeneTAC^TMG3复制了2份,点高密度杂交膜6张,以多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因5＇RACE,GR和3＇RACE＋GR为探针初步筛选到19个阳性克隆,两文库为多枝赖草抗性基因的克隆、物理图谱的构建、功能验证等基因组有关研究奠定了基础。     

细菌人工染色体基因组文库构建关键技术研究

基因组文库是进行分子克隆和基因结构与功能研究的基础,完整覆盖的基因组文库的构建,使基因组任何DNA片段的筛选和获得成为可能.细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)与其它载体系统相比具有转化效率高、嵌合体少、插入片段易回收,高覆盖率、稳定性强,并且具有易分离和操作等特性等优点而被广泛应用.作为物种保护策略的重要部分,构建我国濒危动植物品种基因组BAC文库,对于其遗传资源的保护和研究具有非常重要的作用.在查阅大量国内外相关资料的基础上,就BAC基因组文库构建过程中栽体的制备、高分子量DNA的制备、大片段DNA的回收、连接与电击转化、基因组BAC文库质量鉴定等几个重点、难点问题进行了详细的论述和分析,对于构建高分子量插入片段、高覆盖率和稳定性的基因组文库提供理论基础与技术支撑.     

细菌人工染色体文库的构建及应用

细菌人工染色体（BAC）是第二代大片段DNA的克隆载体系统,具有容量大、嵌合率低、遗传特性稳定、转化效率高、插入片段易回收、操作简便等优点,因而被广泛应用于基因组较大的真核生物基因组研究中,并发挥着前所未有的重要作用。本文综述了BAC的发展,利用此载体构建基因组文库的程序和鉴定方法,及其在物理图谱构建、图位克隆、基因组测序、转基因技术等研究中的应用。     

利用烟草基因组DNA构建近随机多肽文库

介绍一种新的方法构建近随机多肽文库。选取从大基因组物种的组织或细胞中提取的基因组DNA ,利用切割频率高的限制性内切酶切割 ,产生的短片段可以近似地认为是随机序列的片段 ,将它们与匹配的载体连接后转化进宿主细胞进行表达 ,从而获得近随机多肽文库。这样的文库可以用于蛋白质相互作用的研究。同一种基因组DNA可以利用不同的酶切 ,再分别连接到表达载体的不同读码框架 ,从而产生不同编码序列的多种近随机多肽文库。介绍了充分利用烟草基因组DNA构建两种不同酶切 ,三种读码框架 ,共六种不同编码序列的近随机多肽文库的方法。     

古DNA单链测序文库的建立与检测北大核心CSCD

2005年问世的第二代测序技术在古DNA领域的应用,突破了第一代测序技术在绝灭或死亡生物全基因组获取手段上的局限。借助古基因组信息,研究者能够从更为系统的实时分子证据角度,解读诸如人类起源、大型绝灭哺乳动物迁移演化、动植物家养驯化以及早期人类社会生活模式等古生物学、遗传学与演化生物学问题。引入第二代测序技术之后,传统的古DNA研究方法及流程得以改变,剔除了原有的实验流程中耗时的分子克隆步骤,引入了与第二代测序技术紧密相关的古DNA单链测序文库构建环节。古DNA单链测序文库的构建,是将古DNA双链模板变性成单链后,通过向单链古DNA两端添加人工DNA片段,将古DNA分子转变成能被测序仪识别的文库分子。针对古DNA分子微量、高度片段化以及普遍存在碱基损伤的特点,古DNA单链测序文库,能够高效获取古DNA材料中的遗传信息。本文系统介绍古DNA单链测序文库建立流程,以及对文库质量进行检测的方法,为研究者运用第二代测序技术测定绝灭或死亡生物全基因组提供方法借鉴。