向日葵V-ATPasea3亚基基因的克隆及表达分析

采用RACE技术,从向日葵P50中克隆V-ATPase a3亚基基因c DNA全长,并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR分析不同浓度、不同时间的Na Cl、ABA和PEG模拟干旱胁迫条件下V-ATPase a3亚基基因的表达特征,以及相同胁迫条件下该基因在向日葵不同器官的表达特征。序列分析表明,该基因c DNA全长2 873bp,含5'-UTR 109bp、3'-UTR 295bp及编码区2 469bp,编码822个氨基酸,其编码蛋白质的理论分子质量为204.55k Da,等电点为6.29,Gen Bank登录号为KU315054。该基因编码的蛋白质为疏水性的跨膜蛋白,亚细胞定位预测其在质膜上。向日葵V-ATPase a3亚基与已报道的10种植物的V-ATPase a3亚基的同源蛋白有高度相似的保守区域,在进化上与朝鲜蓟的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,向日葵受到Na Cl、ABA和PEG模拟干旱三种非生物胁迫后,V-ATPase a3亚基基因均上调表达,但表达模式不同,不同器官存在特异性表达差异。研究认为,V-ATPase a3亚基基因响应了向日葵非生物胁迫的应答,为加强对V-ATPase基因的利用奠定基础。     

向日葵ACC氧化酶基因(HaACO1)的克隆及表达分析

目的:克隆向日葵中的ACC氧化酶基因(HaACO1),并对其进行生物信息学分析及盐胁迫表达分析,为理解向日葵ACC氧化酶生理功能并加强对ACO基因的利用奠定基础。方法:以前期从盐胁迫的内葵杂4号根中获得的ACC氧化酶基因片段4-4-7TDF(KM823963)为基础,通过RT-PCR和5'/3'RACE技术克隆ACO基因的全长cDNA序列,利用生物信息学软件对获得的cDNA序列及编码的蛋白质序列进行分析。同时采用PCR方法克隆基因组DNA(genemic DNA,gDNA)序列,并对其进行结构分析。利用实时荧光定量PCR分析Na Cl胁迫下向日葵根、下胚轴、叶中HaACO1的表达量和不同NaCl浓度及不同胁迫时间下根中Ha ACO1的表达量。结果:Ha ACO1的cDNA序列全长为1 135bp,其开放阅读框为942bp,编码313个氨基酸。预测其分子质量和等电点分别为35.84k Da和5.13,基因登录号为KP966508。HaACO1与已报道的多种植物的ACO基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列有较高的相似性,分别为76%~83%和77%~88%。gDNA起始密码子至终止密码子序列长1 018bp,包含2个外显子和1个内含子,基因登录号为KP988289。实时荧光定量PCR分析表明向日葵HaACO1在不同器官及不同NaCl浓度、不同时间诱导下存在特异性表达差异。结论:获得的向日葵HaACO1是植物ACO家族成员之一,该基因应答盐胁迫具有独特的表达模式。     

柠条锦鸡儿CkLEA1基因克隆及表达分析

植物受到逆境胁迫后,大量逆境响应基因会被诱导表达,LEA蛋白编码基因就是与植物抗旱、抗冷等非生物胁迫密切相关的一类基因.从已构建的柠条锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中筛选到了一条LEA蛋白编码基因并进行了克隆.序列比对与系统进化分析显示该基因属于LEA3基因家族成员,命名为CkLEA1(GenBank登录号是KC309408).克隆得到该基因gDNA长469bp,包含两个外显子和一个内含子;cDNA长357bp,包含300bp的开放阅读框,推导编码99个氨基酸的蛋白质.利用荧光定量PCR技术对CkLEA1基因在各种逆境胁迫条件的表达情况进行初步研究表明,CkLEA1受干旱、ABA、冷、热、盐和碱等处理不同程度地诱导,推测其与柠条锦鸡儿响应逆境胁迫的机制有关.     

丹参转录因子SmMYB52的基因克隆、表达分析和亚细胞定位

MYB转录因子家族是植物界最大的转录因子家族之一,在植物生长发育、响应生物、非生物胁迫方面发挥重要作用.本研究分别从gDNA和cDNA水平上克隆得到丹参R2R3-MYB转录因子亚家族第24亚组的基因SmMYB52的全长序列,该基因序列全长1 041 bp,包含2个内含子序列和879 bp完整的CDS(Gen-Bank登录号:KF059406),编码292个氨基酸.运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析以及生物信息学分析发现,SmMYB52与拟南芥MYB转录因子AtMYB93亲缘关系最近.利用RT-qPCR测定SmMYB52基因在各器官中的表达,结果显示该基因在根、茎、叶和花中均有表达,根中表达量最高,茎中最低.构建融合表达载体分析SmMYB52蛋白的亚细胞定位,结果显示SmMYB52在细胞核和细胞膜中均有分布.本实验为进一步研究SmMYB52在丹参中的生物学作用提供了科学依据.     

丹参转录因子SmMYB52的基因克隆、表达分析和亚细胞定位

MYB转录因子家族是植物界最大的转录因子家族之一,在植物生长发育、响应生物、非生物胁迫方面发挥重要作用.本研究分别从gDNA和cDNA水平上克隆得到丹参R2R3-MYB转录因子亚家族第24亚组的基因SmMYB52的全长序列,该基因序列全长1 041 bp,包含2个内含子序列和879 bp完整的CDS(Gen-Bank登录号:KF059406),编码292个氨基酸.运用生物信息学软件对该基因及其编码蛋白进行结构和理化性质分析以及生物信息学分析发现,SmMYB52与拟南芥MYB转录因子AtMYB93亲缘关系最近.利用RT-qPCR测定SmMYB52基因在各器官中的表达,结果显示该基因在根、茎、叶和花中均有表达,根中表达量最高,茎中最低.构建融合表达载体分析SmMYB52蛋白的亚细胞定位,结果显示SmMYB52在细胞核和细胞膜中均有分布.本实验为进一步研究SmMYB52在丹参中的生物学作用提供了科学依据.     

木薯MeASR基因克隆及表达分析

脱落酸-胁迫-成熟诱导蛋白(Abscisic acid-stress-ripening,ASR)在植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。利用PCR技术从木薯中克隆了第一个ASR基因Me ASR,序列分析表明该基因开放阅读框(ORF)330 bp,编码109个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明该基因所编码的蛋白具有ASR家族蛋白的保守结构域,与番茄ASR家族蛋白Sl ASR4具有较近的亲缘关系。亚细胞定位分析表明Me ASR定位在细胞核,实时荧光定量PCR分析表明该基因的表达显著受渗透胁迫和ABA诱导。结果表明,Me ASR可能作为转录因子参与木薯对干旱逆境胁迫应答及ABA信号调节。     

苎麻转录因子基因BnMYB3的克隆及表达分析

该研究采用RACE技术,从苎麻中克隆到1个MYB转录因子基因(BnMYB3)的全长cDNA序列(GenBank登录号为MF741320.1)。生物信息学分析表明,BnMYB3基因cDNA全长为1 216bp,包括900bp编码区序列,编码含有299个氨基酸的蛋白,其分子量约为33.63kD,理论等电点为9.16;该蛋白质含有2个典型的MYB结构域,属于R2R3-MYB。从苎麻基因组中克隆了BnMYB3基因1 681bp启动子序列,该序列包含ABRE、GARE-motif、CGTCA-motif和TGACG-motif等多个逆境相关的顺式作用元件。实时荧光定量PCR分析表明,BnMYB3为组成型表达基因,在茎和叶中的表达量显著高于根;BnMYB3基因能够响应镉胁迫,且表达量随镉胁迫处理时间和处理浓度的增加而显著上升。     

毕氏海蓬子SbDREB基因的克隆与表达分析研究

以毕氏海蓬子的基因组为模板,通过PCR技术扩增到一个编码DREB蛋白AP2保守结构域的基因片段;根据该片段序列设计引物,以毕氏海蓬子经NaCl处理的植株肉质茎cDNA为模板,应用RACE技术获得该基因的cDNA全长,命名为SbDREB(GenBank登录号:JF894301)。SbDREB基因cDNA全长1206bp,包含一个编码284个氨基酸的完整开放阅读框。对氨基酸序列比对分析表明,该蛋白在靠近N端具有典型的AP2/EREBP保守结构域,且该结构域与一些高等植物DREB类转录因子的AP2区域具有高度同源性。进化树分析表明SbDREB属于DREB亚家族中的A-6亚族。实时荧光定量PCR结果显示:干旱、高盐和ABA能够诱导其表达,而低温则使其表达下调,表明该基因在毕氏海蓬子植株对干旱、盐和低温等非生物胁迫的应答中起作用。     

西伯利亚蓼钙调蛋白基因的克隆及其在盐胁迫下的表达

已从西伯利亚蓼叶中cDNA文库中获得的钙调蛋白EST序列,采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术克隆了具有完整编码区的钙调蛋白基因的cDNA序列（GenBank登录号GQ988382）,命名为PsCaM。该基因全长615bp,编码区为450bp,编码149个氨基酸,5＇非翻译区为63bp,3＇非翻译区为102bp。同源性分析表明,该蛋白与其他植物钙调蛋白高度保守,氨基酸同源性高达98%。用实时荧光定量PCR研究3%NaHCO3胁迫下西伯利亚蓼基因表达的结果显示,自然条件下,该基因在叶中表达量最高,地下茎次之,茎中最低;盐胁迫下CaM在西伯利亚蓼的地下茎、茎和叶中均有表达,表达模式不同。     

牡丹PoSAD基因克隆与表达分析

以凤丹牡丹(Paeonia ostii)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法,克隆得到凤丹牡丹硬脂酰-ACP去饱和酶基因SAD的cDNA全长,命名为PoSAD(GenBank登录号为KY038819)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 559bp,其中开放阅读框1 197bp,编码398个氨基酸,3′端非编码区长172bp,5′端非编码区长123bp。多序列比对结果表明,凤丹牡丹PoSAD氨基酸序列含有2个保守结构域。系统发育分析结果显示,凤丹牡丹与蓖麻处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PoSAD蛋白无跨膜区域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性结果分析表明,PoSAD基因在凤丹牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,且在花瓣中表达量最高,雌蕊中次之,在根中的表达量最低;不同时期种子中,60d表达量最高,80d次之,10d中表达量最低。     

油葵HaGPAT1基因的克隆及表达分析

该研究利用RT-PCR技术,从油葵(Helianthus annuus L.)种子中克隆了甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)基因(HaGPAT1),对其进行生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测该基因在不同组织、种子不同发育时期以及不同胁迫条件下的表达特征。结果表明:HaGPAT1基因全长为1 656bp,编码551个氨基酸,相对分子量为62.132kD,等电点为8.84。系统进化树分析表明,HaGPAT1蛋白与高等植物莴苣的GPAT1亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,HaGPAT1基因在油葵花蕊中的表达水平最高,开花后17d的种子中次之;在干旱和盐胁迫条件下,HaGPAT1基因的表达水平均显著上调。研究推测,HaGAT1基因可能在油葵花器官发育中发挥重要作用,并且参与了油葵对干旱和高盐的抗性调节。     

向日葵E3泛素连接酶基因的分析定位和表达鉴定

该研究利用前期获得的向日葵耐盐相关基因E3泛素连接酶基因序列(HERC2),构建瞬时表达载体Cam-35S-HERC2-GFP,采用基因枪法转化洋葱表皮细胞进行亚细胞定位;采用RT-PCR技术,分析盐胁迫下HERC2在耐盐品种P50和盐敏感品种P29根、下胚轴和叶中的表达差异;构建HERC2植物表达载体pPZP221-HERC2,采用农杆菌介导法将HERC2导入烟草,进行耐盐功能验证。结果表明:(1)HERC2蛋白定位在细胞膜、细胞质和细胞核中。(2)受到NaCl胁迫后,HERC2基因在耐盐品种P50和盐敏感品种P29中均上调表达,但耐盐品种中的表达量较高。(3)HERC2基因的表达,能够提高转基因烟草的耐盐性。该研究结果为进一步解析向日葵对盐胁迫的响应机制,以及耐盐新品种的选育奠定了基础。     

丹参抗性基因SmORA1的克隆及诱导表达分析

该研究采用PCR方法从丹参中克隆出一条乙烯应答因子结合蛋白(ERF)转录因子编码基因,命名为SmORA1,GenBank登录号为KT359598。经分析发现该基因全长648bp,不包含内含子,编码206个氨基酸残基。编码蛋白SmORA1含有典型的AP2结合结构域。表达分析结果表明,SmORA1主要在丹参根中表达,且该基因的表达明显受到茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、乙烯(ET)、机械创伤和病原菌等逆境信号的诱导,但低温和脱水情况下SmORA1表达下调。研究表明,SmORA1参与丹参生物胁迫反应,可整合JA、ABA、ET和病原菌等胁迫信号途径。     

甘蓝型油菜BnFLA基因的克隆及表达分析

利用同源克隆法从甘蓝型油菜中获得了1个类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白基因(FLA),命名为BnFLA。BnFLA基因开放阅读框长为1 200bp,编码399个氨基酸,分子量为42 885.9Da,等电点为6.37。预测的BnFLA蛋白包含N-端信号肽、2个AGP-like结构域、2个fasciclin-like结构域和C-端GPI-anchor序列。系统进化分析表明BnFLA氨基酸序列与BrFLA17和AtFLA2进化关系较近,一致性分别为98%和87%。qRT-PCR分析表明,BnFLA基因在油菜各组织均有表达,并以下胚轴中表达量最高,其次为子叶,茎秆中表达最少;BnFLA基因的表达受到GA3、BR、IAA、ABA和NaCl的诱导,但受6-BA、蔗糖、低温和PEG抑制。研究认为,油菜中BnFLA基因可能参与激素信号转导途径和非生物胁迫应答。     

苦荞转录因子基因FtbHLH4的克隆及其对非生物胁迫的应答

根据苦荞花期转录组数据,克隆得到1个苦荞bHLH类转录因子基因,命名为FtbHLH4。采用实时荧光定量PCR技术,分析了非生物胁迫对苦荞芽期FtbHLH4基因表达的影响。序列分析表明,苦荞FtbHLH4基因DNA全长1 852bp,由7个外显子和6个内含子构成,符合GT-AG剪接原则;cDNA序列包含1个1 062bp的开放阅读框,编码353个氨基酸,具有bHLH类蛋白典型的螺旋-环-螺旋保守结构域。在脱落酸(ABA)、NaCl和PEG模拟干旱胁迫下,苦荞芽期FtbHLH4基因表达量均持续上升,至48h时达最大,分别为胁迫前的11.3倍、12.0倍和6.1倍。而在冷胁迫和UV-B胁迫下,苦荞芽期FtbHLH4基因表达量迅速下降,分别于6h和12h降低至胁迫前的24%和23%。研究推测FtbHLH4基因以不同机制参与了苦荞对非生物胁迫的应答过程。     

藜麦CqSAP8基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

该研究根据NCBI公布的藜麦胁迫相关蛋白(SAP)基因CqSAP8序列进行克隆,利用生物信息学分析CqSAP8蛋白序列、理化性质和结构特点,并采用qRT PCR方法检测CqSAP8基因表达的组织特异性及在非生物胁迫下的相对表达。结果表明：(1)藜麦CqSAP8基因CDS全长528 bp,编码175个氨基酸;预测CqSAP8蛋白分子量为18.73 kD,理论等电点为7.46,属于稳定的亲水性蛋白质;CqSAP8蛋白在N端和C端分别含有A20和AN1保守域,是SAP蛋白最典型的类型。(2)序列比对与进化分析显示,藜麦CqSAP8与甜菜BvSAP8、菠菜SoSAP8亲缘关系最近,序列相似性分别为89.66%和89.47%。(3)qRT PCR分析表明,藜麦CqSAP8基因在根、茎、叶、花和种子中均有表达,且在种子中表达量最高;CqSAP8基因在干旱和高温胁迫12 h表达量达到最大值,分别是对照的13.09和17.47倍,高盐和低温胁迫下的最大表达量均为对照的3.91倍,说明藜麦CqSAP8基因响应多种非生物胁迫应答;另外,藜麦CqSAP8的表达量在ABA胁迫下24 h急剧升高,推测CqSAP8基因在非生物胁迫前期的响应不依赖ABA。该研究为进一步研究CqSAP8基因功能及抗逆分子机制奠定了基础。     

水母雪莲通气组织形成的相关基因SmLSD1克隆及表达

该研究以水母雪莲为实验材料,通过RT-PCR结合RACE技术克隆了通气组织形成相关基因SmLSD1(GenBank登录号为OL690334),并对该基因在不同胁迫下的表达量及编码蛋白结构进行测定分析。结果表明：(1)水母雪莲SmLSD1基因全长965 bp,包含537 bp的开放阅读框,编码178个氨基酸。(2)同源序列比对发现,水母雪莲SmLSD1蛋白与菊科植物牛蒡LSD1的氨基酸序列相似性最高,达到98.31%。(3)亚细胞定位显示SmLSD1基因主要在细胞核和细胞膜上表达;原核表达显示,SmLSD1基因编码氨基酸的分子量约为18 kD。(4)荧光定量分析显示,SmLSD1基因在根、茎、叶中均有表达,且在叶片中表达量最高;在低温、低氧及紫外胁迫下,SmLSD1基因的表达量下调。研究推测,SmLSD1基因在水母雪莲通气组织的形成以及对逆境胁迫的响应中发挥着重要作用。     

沙冬青AmFAD2-1基因的克隆及其功能分析

细胞膜脂的不饱和度主要由脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)决定,二者与植物抵抗低温和高盐等逆境胁迫密切相关。沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)是中亚荒漠区唯一的常绿旱生阔叶植物,具有很强的耐寒、耐旱和耐盐碱等特性。该研究利用RT-PCR方法克隆到沙冬青油酸去饱和酶基因AmFAD2-1的cDNA和gDNA,其中后者不含内含子。在AmFAD2-1蛋白(含382个氨基酸残基)序列中含有FAD家族必须的保守组氨酸簇和内质网定位信号及跨膜结构域。进化分析表明,AmFAD2-1与大豆(Glycine max)和柠条锦鸡儿(Caragana korshinskii)等豆科植物的FAD2距离较近,而与玉米(Zea mays)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)等其他植物的FAD2距离较远。qRT-PCR分析表明,在室内培养的沙冬青幼苗中,AmFAD2-1的表达量在低温处理2～24h和干旱处理6～13d期间显著上调,在盐胁迫处理期间则呈现升高、降低、再升高的变化趋势;在野外生长的沙冬青成株嫩叶中,其表达量在秋季和冬季总体上明显高于春季和夏季。成功构建了植物表达载体p3300-35S-AmFAD2-1并通过根癌农杆菌介导法转化野生型拟南芥,获得16株转AmFAD2-1基因植株。耐逆性鉴定表明,转基因株系的耐冻性较野生型拟南芥显著提高,其耐旱性和耐盐性也比后者有较明显的改善。     

辣椒CaNAC55基因克隆与表达分析

为揭示辣椒NAC转录因子的功能,以高抗疫病辣椒CM334为试验材料,克隆获得CaNAC55基因全长gDNA和cDNA序列。生物信息学分析表明,CaNAC55基因gDNA全长4 164 bp, cDNA完整开放阅读框(ORF)为1 299 bp,基因编码的蛋白由432个氨基酸残基组成;基因序列比对和同源性分析结果表明,CaNAC55与辣椒(XM-016722474)、番茄(XM-004241285)和马铃薯(XM-006361027)的亲缘关系最近,氨基酸相似度分别达到99.87%、93.37%和92.62%。实时荧光定量分析表明,干旱、高盐、热激处理均可诱导CaNAC55基因表达,其中干旱、高盐、热激处理分别在24 h、24 h和12 h时表达量达到峰值,且分别为对照的3.01倍、20.92倍和8.84倍;ABA处理下,CaNAC55基因的相对表达量显著低于对照,说明CaNAC55基因的表达受到ABA的抑制。研究表明,辣椒CaNAC55转录因子对不同逆境胁迫的响应不同,推测辣椒CaNAC55基因可能作为重要的调节因子参与逆境胁迫响应。     

甘蓝型油菜热激转录因子的克隆及表达分析

以甘蓝型纯系油菜为试材,用RT-PCR和RACE方法首次从油菜种子中获得油菜热激转录因子的cDNA全长序列,命名为BnHSFA4a,GenBank登录号为HQ435241。结果表明:该cDNA长1 667bp,编码1个具有389aa的蛋白质,该基因编码的氨基酸序列与拟南芥热激转录因子AtHSFA4a编码的氨基酸序列间相似度为82%。对34条编码不同热激转录因子的氨基酸序列进行多重比对,结果在100～190aa处序列间氨基酸总相似性超过60%,显示出较高的保守性。构建原核表达载体并成功表达出预期蛋白。半定量RT-PCR结果显示,该基因的表达先于油菜肌醇半乳糖苷合成酶(BnGOLS1)基因,符合该基因调控BnGOLS1的假设。推测AtHSFA4a基因可能通过调控BnGOLS1的表达量进而在油菜种子脱水耐性获得过程中发挥一定的作用。