一种高效产生小鼠杂交瘤的电融合方法

近年来,细胞电融合技术(Electrofusion)得到了迅速发展和应用.特别是在单克隆抗体领域,人们希望能以电融合技术的高融合频率来更有效地获得分泌单抗的杂交瘤.现主要有两种较有效的电融合方法来实现这一目的:一是Nova/Hopkins的抗原—抗生物素—生物素桥联(antigen-avidin-biotin bridge)方法,另一种则是Zimmermann电融合法.Nova/Hopkins方法虽然非常有效,但其较适用于中高亲和性的抗原—抗体系统     

电融合产生黄瓜花叶病毒的单克隆抗体

用提纯的黄瓜花叶病毒(CMV)种传SS-30株和豇豆株(P株)混合免疫BALB／c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0,用BAEKON 2000基因转移仪使其融合。通过2—3次简易、快速的有限稀释,获得6个能持续分泌抗体的杂交瘤细胞株,所获抗体分属IgG．和IgG∽井能诱导高滴度腹水抗体。间接ELISA试验证明这些单克隆抗体对种传CMvss一30株、P株和非种传CMV的黄化、日本、山东、香蕉。向日葵和Q等分离物有特异性反应,与c,·分离物的反应性较弱,而对花生矮化病毒(PSV)无交叉反应。利用间接ELISA测定了几个单克隆抗体的亲和力常数。单克降抗体C7H3、A6H4与G4G4、G4H5所抗的抗原决定簇相距较远,而C2H3 与A6H4 G+G8与G4H4为抗同一抗原决定簇的草克隆抗体。     

电融合方法建立抗结核杆菌单克隆抗体细胞株

By using the electrofusion tecndque, the fusion of NSI myeloma cells with spleen cells of BALB / c mouse immunized with five species of mycobacteria was caaced cuL With the ophmal electrofUSion condihons, we obtained a high fuSion efficiency of l.75 hybrid cell clones per 105 spleen cells. ELISA was used for screening secrehng anhmycobacteria McAb hybrid cells. After cloning, 22 stable hybrid cells'lines were selected, and 8 of them had been studied.     

同源基因拼接技术在酶体外进化中的应用

同源基因拼接技术是一种全新概念的酶人工定向进化策略,本文在介绍这一技术基本概念的基础上,主要对该技术的两个关键环节;突变体基因库的构建以及高通量的重组子筛选手段进行详细论述,最后对该技术在酶改性中的应用研究进展进行综述,并对其发展前景及存在问题进行评述。     

遗传工程技术公司基因拼接研究的几项重大成就和最新突破

近几年来,随着重组DNA技术或者叫基因拼接技术的发展,提出了许多新的方法来生产有治疗作用的人类蛋白质。这些方法都是基于将编码蛋白质的基因片段拼入细菌的正常DNA内,然后进行无性增殖,以微生物发酵法生产大量的人类蛋白质或其它有用物质。不仅如此,用基因拼接技术,还可对自然界中的天然药物进行鉴定,并将其中有明显用处的那些天然药物以更新更有效的基因拼接方法进行大量生产。     

可诱导结瘤基因nodA的体外转录

报道结瘤基因nodA的体外诱导转录 :当转录体系中有一定量的调控蛋白NodD和植物诱导分子柚皮素 (naringenin )存在时 ,在体外转录的产物中始终存在着与体内转录相一致的特异产物。体外诱导转录表明 ,可诱导结瘤基因nodA在体内转录时 ,可能同样存在NodD蛋白、柚皮素诱导剂分子和nodA启动子的某种方式的直接相互作用     

基因工程抗体研究进展

基因工程抗体研究进展刘喜富,黄华梁（中国科学院遗传研究所北京１００１０１）自１９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ等创立了杂交瘤技术以来,单克隆抗体已广泛应用于临床疾病的诊断,治疗和预防以及基础理论研究等多个领域,取得了令人鼓舞的结果。但由于鼠单克隆抗体对人体具有免疫原性,不能重复使用,影响疗效,而且生产单抗的成本较高,难以普及使用,围绕如何降低鼠源单克隆抗体的免疫原性以及在大肠杆菌中表达抗体基因的问题, 基因工程抗体技术得以产生和发展。     

基因工程抗体中噬茵体抗体库技术的应用

通过基因工程可以大规模地制备能与人相容的单克隆抗体或片段.其中,噬茵体抗体库技术可以模拟体内抗体产生和成熟过程,不经细胞杂交,甚至不经免疫制备针对任何抗原的单克隆抗体.就基因工程抗体及噬茵体抗体库技术的发展与应用作一概述.     

基因拼接技术对化学和能源工业的影响

美国康涅狄格州诺沃克一家高级技术市场研究和管理咨询公司--工业资源开发公司,最近发表一份题为《遗传工程对能源影响》的报告。     

治疗性抗体的研究进展

作为一种具有靶向性的生物大分子,单克隆抗体始终是人们关注的热点之一,被广泛用于治疗肿瘤、病毒感染和抗移植排斥等。但鼠源单克隆抗体的临床应用受限于诱导产生人抗鼠抗体、肿瘤渗入量低、亲和力低和半衰期短等。随着分子生物学技术的发展及其向各学科的渗透,通过基因操作技术对抗体进行改造,可使其适用于多种疾病的治疗。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现,它们从不同角度克服了抗体本身的应用局限,也为治疗人类疾病提供了利器。本文简要介绍上述技术的基本原理、特点和治疗性抗体的研究进展。     

人B细胞永生化研究进展

人源单克隆抗体具有免疫原性低、半衰期长等优势,成为了体内应用中不可或缺的生物制剂.人类抗体库为人源单克隆抗体的制备提供了丰富的来源,人B细胞永生化是获得人类抗体库的潜在有效方法,可应用于人源单克隆抗体的制备.由于各平台均有亟待解决的问题,基于人B细胞永生化的抗体制备尚局限在实验室研究阶段,且目前尚缺乏一篇系统综述以明确...     

用于重组抗体生产的细胞大规模培养技术

近年来,用于单抗药物生产的动物细胞大规模培养技术发展迅速.此领域的技术进展集中在个性化培养基开发,工艺条件优化等方面.本文总结了用于提高重组抗体表达水平的常用方法,以及细胞培养工艺对抗体药物“关键质量属性”(聚体、降解、糖基化修饰、电荷变异等)的诸多影响.此外,细胞培养工艺在产业化过程面临着工艺放大与技术转移,定性研究与工艺验证等实际问题.未来大规模细胞培养工艺的开发,将进一步借助动物细胞的组学研究成果和新兴的“过程分析技术”.     

噬菌体抗体库技术筛选抗VEGF165单克隆抗体

目的:获得抗血管内皮生长因子165(VEGF165)单克隆抗体,并对其功能进行初步验证。方法:利用噬菌体抗体库展示技术筛选与VEGF165结合的噬菌体克隆并测序,以测序正确的阳性克隆质粒为模板,PCR扩增抗体的轻重链可变区基因,并克隆至哺乳动物细胞表达载体中,构建全抗体表达载体;将全抗体表达载体转染293E细胞,收取培养细胞上清,利用ProteinA亲和纯化抗体;通过结合ELISA、表面等离子共振检测抗体的亲和力,以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为模型验证抗体功能。结果:经过噬菌体抗体库展示技术筛出1个与VEGF165特异性结合的抗体序列VG2;293E细胞表达了VG2全抗体蛋白,SDS-PAGE显示VG2抗体纯度较高;BIAcore检测结果表明该抗体具有较高亲和力(KD=0.56nmol/L),竞争抑制ELISA结果表明VG2抗体能抑制VEGF与VEGF受体(VEGFR)的结合(IC50为1.470μg/mL),进一步实验结果表明VG2能够抑制VEGF引起的HUVEC增殖。结论:制备了靶向VEGF165的全人源单克隆抗体VG2,该抗体具有较高的亲和力,能阻断VEGF165/VEGFR2的结合,并抑制HUVEC的增殖,可以作为潜在药物应用于肿瘤治疗。     

噬菌体呈现技术制备结肠癌抗独特型抗体

 以纯化的鼠抗人结肠癌细胞单克隆抗体 (简称单抗 )MC5与钥孔血蓝素 (KLH)的交联物经腹腔免疫Balb c小鼠 ,取脾分离mRNA .RT PCR分别扩增抗体重、轻链可变区基因片段 (VH 和VLcD NA ,大小分别约为 340bp和 32 0bp) ,二者经linkerDNA连接形成ScFv(singlechainvariablefragment)DNA(约 75 0bp) .将ScFvDNA与噬菌粒载体pCANTAB5E的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13KO7感染后 ,获得重组噬菌体抗体ScFv文库 .以单抗MC5对ScFv文库进行 4轮亲和筛选后 ,随机挑取 80个克隆经酶联免疫吸附实验 (ELISA)筛选出 2 2个呈现ScFv形式抗独特型抗体(抗 IdScFv)的噬菌体单克隆 .竞争抑制实验表明 ,在 2 2个阳性克隆中有 4个克隆所呈现的抗 IdScFv属β或γ型 .针对单抗MC5的噬菌体呈现型抗 IdScFv的制备 ,为筛选新的结肠癌重组抗 Id瘤苗候选分子奠定了基础     

人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化及其相关基因鉴定

目的:探讨人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的分离提取、体外诱导分化为脂肪细胞的能力及其相关基因的表达情况。方法:取新生儿脐带经组织培养法提取后分离培养于αMEM完全培养基中,经大量纯化与扩增后,采用倒置显微镜观察其形态与细微结构;流式技术检测其细胞周期及表面标志;以含有成脂诱导剂的αMEM培养基对P3的hUC-MSCs进行培养,诱导其向脂肪细胞方向分化,对其对诱导后的细胞进行检测。应用油红"O"染色对其进行定性鉴定;应用实时定量RT-PCR对LPL、Leptin的基因含量进行测定。结果:经过组织培养法后,细胞呈贴壁生长,细胞呈梭性或旋涡状,形态不规则,多数有凸起,细胞核较大,核仁明显;第7代以前的细胞具有较强的生长活性;流式技术检测发现此类细胞高表达CD44、CD73和CD105等细胞表面标记,而几乎不表达CD34、CD45、CD31和HLA-DR。培养至第3代的细胞约72.724%的细胞处G1期、S期的细胞仅占18.069%,第7代时G1期细胞约为83.875%、S期为9.606%左右;经成脂诱导剂诱导分化后,细胞经油红"O"染色,分化为脂肪细胞的细胞着色并呈红色,实时定量RT-PCR结果显示该部分细胞表达脂肪细胞的标志性基因LPL和Leptin。结论:P7以前的hUC-MSCs具有较强的生长分化能力,可以向脂肪细胞进行分化并表达一定量的特定标志性基因。     

体内诱导抗原技术筛选病原菌体内诱导抗原的研究进展

体内诱导基因是病原菌在宿主体内能够表达而体外培养时却不能表达的功能基因,其对病原体在宿主体内的生存和致病具有重要意义。体内诱导抗原技术(in vivo induced antigen technology, IVIAT)已广泛应用于筛选病原体体内诱导基因,相较于其他用于筛选体内诱导基因的技术,IVIAT具有无需动物模型、检测病原菌在不同感染阶段产生的抗原等独特优势。IVIAT鉴定出的体内诱导抗原对病原体在宿主中的毒力、代谢及存活具有重要意义。现就IVIAT的原理、IVIAT筛选出的人类疾病相关病原菌的体内诱导抗原及其功能研究等作一概述。     

天然属性抗LDL 及oxLDL IgM 亚类抗体的制备与鉴定

目的:制备天然属性抗低密度脂蛋白(LDL)及抗氧化低密度脂蛋白(oxLDL)IgM亚类抗体。方法:给予Babl/c小鼠高胆固醇饮食,4周后取脾细胞直接与SP2/0细胞融合,以纯化的LDL及oxLDL为抗原,对阳性杂交瘤细胞生长孔进行间接ELISA筛选。鉴定杂交瘤上清的免疫球蛋白亚类,进而采用免疫沉淀和免疫印迹法对获得的抗体进行免疫学反应性鉴定。结果:杂交瘤细胞分泌的抗LDL及抗oxLDL的天然抗体通过ELISA法被筛选出来,可以与LDL或oxLDL发生高亲和力结合,经过4次克隆化,最终获得2株稳定分泌天然抗LDL的抗体,命名为5G8和2H7,及1株稳定抗oxLDL的抗体,命名为3A6,3株抗体均属于IgM亚类,无交叉反应,可以满足免疫印迹、免疫沉淀等实验要求。结论:成功制备了抗LDL及抗oxLDL IgM亚类抗体,为研究天然抗体在体内脂质代谢和相关心脑血管疾病如动脉粥样硬化等发生发展中的作用提供了重要的研究工具。     

天然属性抗LDL及oxLDL IgM亚类抗体的制备与鉴定

目的：制备天然属性抗低密度脂蛋白（LDL）及抗氧化低密度脂蛋白（oxLDL）IgM亚类抗体。方法：给予Babl/c小鼠高胆固醇饮食,4周后取脾细胞直接与SP2/0细胞融合,以纯化的LDL及oxLDL为抗原,对阳性杂交瘤细胞生长孔进行间接ELISA筛选。鉴定杂交瘤上清的免疫球蛋白亚类,进而采用免疫沉淀和免疫印迹法对获得的抗体进行免疫学反应性鉴定。结果：杂交瘤细胞分泌的抗LDL及抗oxLDL的天然抗体通过ELISA法被筛选出来,可以与LDL或oxLDL发生高亲和力结合,经过4次克隆化,最终获得2株稳定分泌天然抗LDL的抗体,命名为5G8和2H7,及1株稳定抗oxLDL的抗体,命名为3A6,3株抗体均属于IgM亚类,无交叉反应,可以满足免疫印迹、免疫沉淀等实验要求。结论：成功制备了抗LDL及抗oxLDL IgM亚类抗体,为研究天然抗体在体内脂质代谢和相关心脑血管疾病如动脉粥样硬化等发生发展中的作用提供了重要的研究工具。     

抗iLRP单克隆抗体的制备和鉴定

为了研究抗iLRP (Immature laminin receptor protein)单克隆抗体在免疫治疗中的应用,本研究采用重组iLRP对6~8周龄BALB/c雌性小鼠进行免疫,取免疫后小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0进行细胞融合,在HAT (Hypoxanthine aminopterin thymidine)半固体培养基上挑选分离明显的细胞克隆于96孔板培养后,取上清液通过ELISA法进行克隆筛选,初次筛选得到23株阳性克隆,复筛后得到13株稳定分泌抗体的细胞株。抗体类别鉴定显示,其中9株为IgM,3株为Ig G1,1株为IgG2a,轻链类型都为κ型。其中1株IgG1和IgG2a用于制备小鼠腹水,经Protein-G柱纯化,SDS-PAGE检测抗体纯度,Western blotting验证抗体特异性。结果表明,抗体纯度均大于90%,并与i LRP有明显的特异性结合。此结果为后续的深入研究提供了一套完整有效的抗iLRP单克隆抗体生产和鉴定的程序,对以iLRP为治疗靶点的单克隆药物研究以及最近兴起的CAR-T (Chimeric antigen receptor modified T cell)免疫治疗具有积极的意义。     

嗜水气单胞菌对四环素类药物诱导耐药表型及机理研究

【目的】初步探讨利用四环素类药物体外诱导嗜水气单胞菌耐药后,嗜水气单胞菌对四环素类药物敏感性的变化及其耐药机制。【方法】筛选临床分离嗜水气单胞菌的四环素类敏感株,从含有1/4×MIC的强力霉素的TSA固体培养基开始,等比2倍提高诱导药物质量浓度对受试菌进行连续传代培养,以获得高耐诱导株;测定诱导菌对强力霉素和16种非诱导药物的最小抑菌浓度(MIC)及添加外排泵抑制剂N-甲基吡咯烷酮(NMP)后的MIC,分析其敏感性变化与外排作用的关系;提取诱导菌的DNA,PCR扩增其5个tet基因并测序。【结果】诱导后菌株对强力霉素的MIC显著升高,对非诱导四环素类药物也有不同程度提高,对氟喹诺酮类药物的MIC比诱导前增加几十至上千倍;对氨基糖苷类药物和利福平的MIC则有不同程度的降低;添加NMP后,所有诱导菌株对强力霉素的MIC值均有不同程度的下降;四环素类耐药基因的检测结果表明,在诱导后7号菌株中同时检测到tet A和tet E;在诱导前后的2号菌株中检测到tet C;在诱导前后的1、3、4、5、6、7号菌株中均检测到tet E。【结论】本研究表明tet E基因可能是介导气单胞菌分离株对四环素类药物耐药的优势基因,为阐明嗜水气单胞菌对四环素类药物耐药机制及耐药性与耐药基因之间的关系提供理论依据。