单细胞PCR体系的建立及其在CRISPR/Cas9靶点活性检测中的应用

单细胞PCR是以单个细胞所含的DNA或RNA为模板进行扩增,因此其模板的制备是影响整个反应成功与否的关键因素。利用三种不同蛋白酶K细胞裂解液(SDS细胞裂解液、NP-40细胞裂解液、Tween-20细胞裂解液)分别对体外培养成熟的单个猪卵母细胞进行裂解,并直接作为模板进行PCR扩增,结果表明:NP-40细胞裂解液制备的模板质量最好,其扩增效率为95%;其次为Tween-20细胞裂解液,其扩增效率为65%;SDS细胞裂解液产物中未检测到阳性条带。结合显微注射技术对sgRNA靶点活性进行检测,结果表明利用单细胞PCR结合显微注射的方法,在受精卵内对CRISPR/Cas9靶点活性进行检测确实可行,检测结果真实可靠。     

病毒RNA如何逃避宿主细胞的降解

细胞RNA的降解机制不仅在基因表达调节方面具有重要作用,而且也是一种重要的病毒防御机制. 作为一种必须在细胞内增殖的微生物,病毒已经进化出了多种机制,以保护它们的RNA免被宿主细胞降解,如病毒RNA模拟宿主细胞mRNA的结构、形成磷脂包膜、形成局部二级结构、结合自己或宿主细胞编码的蛋白质和编码核酸酶增强宿主细胞mRNA降解等. 本文主要论述了病毒RNA逃避宿主细胞降解的方式,并对其应用前景进行了展望,尤其是在研发抗病毒药物方面的应用前景.     

从豆科植物的根瘤中直接提取根瘤菌DNA的方法

豆科植物的新鲜根瘤经表面灭菌,破碎后直接加入200μL4mol/L异硫氰酸胍（GUTC）裂解液混匀,离心去掉根瘤残留物,再加入适量RNA酶,37℃温育30min后,加入20μL硅藻土吸附液,室温处理15min离心去掉上清,沉淀经GUTC裂解液二次处理,再分别用洗涤液,室温处理15min离心去掉上清,沉淀经GUTC裂解液二次处理,再分别用洗涤液,70%酒精洗涤,最后,硅藻土沉淀经真空干燥,加入20μL超纯水洗涤硅藻土沉淀,即可获得类菌体根瘤菌DNA,所获得的DNA可以用于AFLP,16SrRNAPCR反应。     

一种同时提取细胞总RNA和总蛋白的方法

应用TRIzol法分步提取总RNA和总蛋白,提取的总RNA亮度强、完整,提取的总蛋白与经常规RIPA裂解液提取的全蛋白的质量相当。验证了从同一批次处理的细胞中同时提取总RNA和总蛋白进行检测分析是可行的,而且确保了实验条件的一致性,缩短了实验周期。     

从血液中提取总RNA的一种快速高效方法

血液中含有大量的RNA酶 ,可引起RNA的降解 .防止RNA酶的降解 ,是保证所得RNA片段完整的关键 .目前提取RNA的方法较多 ,但有些方法尚不能完全防止RNA降解 .将TRIZOL方法稍加改进 ,将TRIZOL与异硫氰酸胍联用提取血液淋巴细胞总RNA .琼脂糖凝胶电泳结果表明 ,其 2 8SRNA与 18SRNA的比值为 2∶1,优于单独使用其中任何一种试剂者 .此方法同样适用于从其它细胞中提取RNA .     

从豆科植物的根瘤中直接提取根瘤菌DNA的方法*

豆科植物的新鲜根瘤经表面灭菌、破碎后直接加入 2 0 0 μL 4mol/L异硫氰酸胍 (GUTC)裂解液混匀 ,离心去掉根瘤残留物 ,再加入适量RNA酶 ,37℃温育 30min后 ,加入 2 0 μL硅藻土吸附液 ,室温处理 1 5min离心去掉上清 ,沉淀经GUTC裂解液二次处理 ,再分别用洗涤液、 70 %酒精洗涤。最后 ,硅藻土沉淀经真空干燥 ,加入 2 0 μL超纯水洗涤硅藻土沉淀 ,即可获得类菌体根瘤菌DNA。所获得的DNA可以用于AFLP、 1 6SrRNAPCR反应。     

BYL无细胞系统对植物RNA病毒翻译复制机制的研究进展

无细胞翻译系统是高效表达重组蛋白质的体外分子研究系统,BYL是一种通过密度梯度离心法脱去液泡的烟草BY-2裂解液无细胞系统。BYL系统可支持外源m RNA以及多种植物RNA病毒的蛋白质表达,由于BYL系统中保留植物RNA病毒复制所需的胞内膜结构,所以该系统可支持RNA病毒核酸负义链、正义链和亚基因RNA的合成。综述了BYL系统应用于植物RNA病毒翻译和复制等机理以及RNA干扰机制方面的研究进展,并对其研究前景进行展望,旨在便于更多的研究者系统了解BYL无细胞系统,将其更广泛地应用于其他RNA病毒的翻译复制机制研究中。     

一种新型的油樟叶片总RNA提取方法

以油樟叶为试材,比较Trizol法、皂土法、CTAB法、Tris-SDS-异硫氰酸胍法等传统方案提取总RNA,发现效果都不理想.本文针对油樟叶片富含油脂、多酚、多糖的特点,开创性地使用了一种改良的总RNA提取流程:首次增加预处理液、乙酸乙酯抽提来减少油脂、多酚和多糖对裂解液粘稠度的影响,提取过程中使用二氯甲烷代替三氯甲烷增加对疏水性杂质的清除效果,使用混合型高盐溶液多次脱糖,结果表明使用改良的新型方法获得的油樟叶片总RNA条带清晰无明显降解,测得的A260/A280和OD260/OD230均在2.0左右,产物得率约580 μg/g,通过RT-PCR扩增出了油樟18S rRNA基因序长为113bp的特异条带,说明这种改良的新型方法获得的RNA完整性、纯度和产率都远高于常规RNA提取方法,研究探索出一种新型油樟叶片总RNA的提取方法.     

siRNA降低肿瘤细胞端粒酶活性的研究

利用T7RNA聚合酶在体外转录合成针对端粒酶模板RNA(hTR)的两条互补单链RNA,经退火形成siRNA.采用TRAP法检测端粒酶活性,分析siRNA在肿瘤细胞裂解液的干扰作用.结果表明:T7RNA聚合酶可以高效地转录出短的单链RNA,制备的siRNA可明显地降低肿瘤端粒酶的活性,其降低肿瘤端粒酶活性的作用强于等量的反义链RNA.该法廉价、高效、简易,有可能为肿瘤的基因治疗提供一种新的探索途径.     

3'-端尿苷酸化引发RNA降解的机制

RNA末端的转录后修饰对其稳定性影响较大.最近研究发现,3'-末端无需模板的添加尿苷酸(尿苷酸化),可能是真核生物RNA的一种普遍存在的转录后修饰方式.借此形成的1个RNA降解的分子标记,引发多种RNA降解,如小RNA或其前体、mRNA或mRNA被RNA诱导沉默复合体内切后的上游片段及其组蛋白mRNA等.某些情况下,尿苷酸化的RNA被1种新发现的外切核酸酶Dis3L2特异降解,推测Dis3L2可能代表了真核生物RNA 3'→5'方向独立于外切体之外的一种新的降解途径.此外,尿苷酸化在RNA代谢中可能具有重要的功能,如果发生异常会导致多种人类疾病,如癌症和Perlman综合征等.本文综述了尿苷酸化引发RNA降解的几种方式,有助于进一步了解RNA降解的机制及其生物学意义.     

自噬在小RNA病毒感染中的作用

自噬是真核细胞所特有的一种高度保守的经溶酶体途径降解细胞内错误折叠或多余蛋白质、受损细胞器、胞内病原体的细胞代谢过程。小RNA病毒脱壳感染细胞时,快速激活自噬途径,诱导形成大量双层膜结构的自噬体。自噬能激活细胞表面的模式识别受体以及干扰素途径,增强组织相容性复合物对病毒抗原的提呈作用,发挥抑制小RNA病毒感染的天然免疫功能;此外,自噬体为小RNA病毒提供复制相关蛋白质和非细胞裂解性释放途径,促进感染细胞的胞内、胞外出现更多成熟的小RNA病毒粒子。该文对细胞自噬与小RNA病毒感染的研究概况与进展作一综述,为进一步开展解析不同小RNA病毒感染与自噬发生的时间、空间等的关系及阐明自噬作用于小RNA病毒感染的分子机制等研究提供参考。     

从生物材料对细胞总RNA量的影响初探其分子生物相容性

目的:从细胞总RNA量的变化观察生物材料有无毒性。方法:将生物材料浸提液作用于成纤维细胞,用异硫氰酸胍一步法抽提细胞总RNA,经RNA电泳和检测和计算其RNA浓度,观察细胞总RNA量的变化。结果:不同的生物材料可引起细胞总RNA量的变化,尤其某种有毒的硅橡胶使细胞总RNA量被严重抑制。结论:观测细胞总RNA量并结合细胞毒性试验及其他分子生物学试验可作为综合评价生物材料分子生物相容性的参考。     

苦荞凝集素对结肠癌细胞增殖的抑制作用

采用醋酸铵缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、阴离子交换和分子排阻层析等方法,首次从苦荞麦中提取出一种苦荞凝集素(tatary buckwheat lectin,TBL). MTT检测发现,TBL对3种结肠癌细胞 DLD-1、HCT116及SW480的增殖有显著的抑制作用,且呈剂量依赖效应,而对正常细胞及其它类型癌细胞的增殖无明显影响. 采用兔网织红细胞裂解系统和荧光素酶检测系统检测TBL对蛋白质合成的影响,结果表明,随着TBL浓度的增大,蛋白质翻译抑制作用逐渐增强,当TBL浓度为40 μg/mL时荧光素酶活性下降至50%. 另外,TBL与兔网织红细胞裂解系统作用后,核糖体RNA出现新的片段,表明TBL具有N-糖苷酶的活性. 将HCT116细胞总RNA与TBL体外作用后,发现二者存在明显的相互作用,核糖体RNA被降解. qRT-PCR检测显示,TBL明显下调HCT116细胞中多种microRNAs (miRNAs) 表达. 综合以上实验得出,TBL是一种Ⅱ型核糖体失活蛋白(type-Ⅱ ribosome-inactivating protein, Ⅱ-RIP)类的植物凝集素,具有N-糖苷酶活性,可下调肠癌细胞中多种miRNAs的表达,抑制结肠癌细胞增殖.     

钙离子信号对非细胞体系中小鼠卵母细胞游离生发泡减数分裂启动的影响

本文构建了包括HeLa裂解液和游离小鼠卵母细胞生发泡的实验体系,用于研究Ca2+及其下游信号对小鼠卵母细胞减数分裂启动的影响.游离的卵母细胞生发泡可以在M期细胞裂解液中发生减数分裂启动,表现为染色质的凝集.进一步的研究表明,Ca2+信号的存在对G2期细胞裂解液促进减数分裂启动是至关重要的,G2期中期的细胞裂解液只有经Ca2+诱导后才具有启动生发泡减数分裂的作用,而G2期晚期无论Ca2+存在与否均诱发减数分裂的启动,但是G2期早期的裂解液元启动减数分裂的作用.卵母细胞的体外培养实验分析也表明,抑制CaM和CaMKII的活性可以阻止GVBD和抑制第一极体的释放.免疫沉淀及Western Blotting结果显示,HeLa细胞裂解液中的MPF从G2期中期到M期均存在,且Cdc2亚基的Tyr由磷酸化向去磷酸化转变.结果进一步证明,卵母细胞减数分裂的启动可能是通过一种Ca2+/CaM依赖的途径来推动的.     

大肠杆菌细胞裂解系统的构建及其在真菌毒素降解酶表达中的应用

目的:大肠杆菌中分泌表达重组蛋白受限于其分泌效率,为此设计构建大肠杆菌诱导裂解系统以实现胞内重组蛋白的快速高效分泌。方法:利用大肠菌素E7对细胞的裂解能力,构建共表达目标重组蛋白和E7的大肠杆菌细胞裂解系统,使目标重组蛋白在E7表达后得以释放到培养基中。结果:首先以红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)为报告基因,在pET28a(+)载体上构建大肠杆菌素E7和红色荧光蛋白两个表达盒,通过对比分析IPTG一步诱导和IPTG-阿拉伯糖分步诱导系统蛋白质的表达效果,发现分步诱导系统能够更高效地表达并释放目标蛋白到培养基。在IPTG-阿拉伯糖分步诱导裂解系统中表达玉米赤霉烯酮降解酶基因,培养基上清液中检测到玉米赤霉烯酮降解酶有较好的表达量和较高的活性,能够在37℃反应30min的条件下降解约5. 8μg玉米赤霉烯酮毒素。结论:利用大肠菌素E7成功构建大肠杆菌细胞裂解系统,并且此系统在快速释放胞内表达外源蛋白方面有适用性。     

小麦叶片暗诱导衰老期间1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的降解

研究了小麦(Triticum aestivum L. cv.Yangmai 158)叶片暗诱导衰老过程中1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco EC 4.1.1.39)的降解.发现在此期间Rubisco大亚基(LSU)发生裂解,产生50 kD的降解条带,同时在自然衰老过程中也检测到这一产物.初步实验结果表明LSU发生这步裂解时Rubisco全酶没有解离.另外,在粗酶液中当温度在30～35℃,pH 7.5时,这一步裂解反应能有效进行.     

三种不同方法固定的石蜡切片中RNA的分析

研究在 10 %中性福尔马林、丙酮、甲醇 氯仿 冰醋酸 3种方法固定的石蜡切片中提取RNA的质量和数量 .取 2 5 0g体重的Wistar大鼠的肾脏 ,分别采用 10 %中性福尔马林、丙酮、甲醇 氯仿 冰醋酸 3种方法固定 ,石蜡包埋 ,H E染色 ;采用RNA裂解液、TRIZOL试剂 2种方法提取切片RNA ,逆转录为cDNA ,采用普通PCR和SYBRGREEN 1定量PCR分析RNA质量和数量 .结果表明 ,3种固定方法都可保持组织良好的结构和形态 ;采用 2种提取方法 ,均可经RT PCR扩增出 180bp大鼠磷酸甘油醛脱氢酶 (G3PDH)、5 6 5bpβ肌动蛋白 (β actin)、10 0bp纤溶酶系活化剂抑制物 1(PAI 1) ;但采用RNA裂解液时 ,比TRIZOL试剂可提取更多的RNA .     

小麦叶片暗诱导衰老期间1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的降解(英文)

研究了小麦(Triticum aestivum L.cv.Yangmai 158)叶片暗诱导衰老过程中1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco EC 4.1.1.39)的降解。发现在此期间Rubisco大亚基(LSU)发生裂解,产生50 kD的降解条带,同时在自然衰老过程中也检测到这一产物。初步实验结果表明LSU发生这步裂解时Rubisco全酶没有解离。另外,在粗酶液中当温度在30～35℃,pH7.5时,这一步裂解反应能有效进行。     

一种高效经济的高质量植物RNA提取方法

建立了一种高效经济的植物RNA提取方法.在提取缓冲液中加入蔗糖、氯化钾和镁离子以提供对RNA分子的保护.破碎后的细胞于提取缓冲液中裂解后,用酚/氯仿变性并去除内源RNA酶和其他蛋白质,而后用pH 5.6 的NaAc沉淀RNA.用该方法提取RNA的得率较高,经电泳检测,RNA的完整性很好.RNA印迹分析和RT-PCR也都得到很好的结果.该方法还使实验成本大大降低.     

双向凝胶电泳比较三种常用蛋白质提取方法

组织(或细胞)的蛋白质提取效率直接影响蛋白质双向凝胶电泳(2-DE)的分辨率.为探索建立适用于人乳腺癌细胞株MCF-7蛋白质提取的最佳条件,比较目前在双向凝胶电泳中常用的3种蛋白质提取方法对MCF-7细胞总蛋白的提取效率.MCF-7细胞经培养后,分别采用M-PER试剂、标准裂解液或含硫脲裂解液提取其总蛋白质,然后进行双向凝胶电泳,并根据凝胶上蛋白质斑点的丰度和分布特点判断所得双向电泳图谱的质量,以确定MCF-7细胞蛋白质提取的相对最佳方法.结果显示,M-PER试剂法得到的图谱分辨率较低,蛋白质主要集中分布在分子量15~70kD,pH4.7~6.3的范围内;标准裂解液法得到的图谱分辨率有所提高,蛋白质分布比M-PER试剂法得到的图谱广;硫脲裂解液法得到的图谱是三者中分辨率最高的,尤其是高丰度蛋白和高分子量蛋白分离效果比前两者好.结果表明,在3种常用的蛋白质提取方法中,硫脲裂解液对细胞蛋白质的溶解性最佳,相对更适合于提取MCF-7细胞的蛋白质,并与双向凝胶电泳条件更兼容.