红景天线粒体nad7基因内含子2序列测定及其系统发育意义

开展濒危藏药红景天的分子生物学研究, 可以为红景天遗传资源鉴定与保护提供指导。利用线粒体中nad7基因的保守序列设计的引物, 对分布于四川的大花红景天、长鞭红景天和吉林的高山红景天等9份材料进行PCR分析, 发现在所有的红景天材料中均获得约800 bp的扩增产物。进一步对扩增片段进行序列测定, 结果表明该片段除具有53 bp的外显子区外, 其内含子长度均为738 bp, 有9个核苷酸变异位点。将测定序列进行比对和聚类分析表明, 红景天线粒体nad7内含子2序列被单独聚类。而且测定的红景天的nad7 内含子 2序列, 其长度均小于其他高等植物的同源序列, 体现了红景天属植物的该基因区域的特异性, 可能与特殊的生态环境有关。     

番茄抗病基因Cf9的3‘UTR区含有内含子序列

从番茄抗病品种“中杂９号”基因组ＤＮＡ中扩增并克隆了番茄抗叶霉病基因Ｃｆ９。序列分析结果表明,该基因全长２７５１ｂｐ,含有一个编码８６３个氨基酸的开放阅读框架。在该基因的３＇ＵＴＲ区发现了一段未曾报道的内含子序列,长１１５ｂｐ,它所处的位置与番茄另一个抗叶霉病基因Ｃｆ２内含子的位置相似,其５＇和３＇边界序列为一重复序列,ＴＣＣＡＧＧ（Ｔ）ＡＴＴＣ,并与Ｃｆ２基因内含子边界序列高度同源。与已报道的Ｃ     

基因外显子连接序列与相应内含子序列的相互作用

剪接后的内含子与相应mRNA序列的相互作用在基因表达调控过程中起着非常重要的作用。基于27个物种的核糖核蛋白基因序列,采用Smith—Waterman局域比对方法得到外显子连接序列与相应内含子序列的最佳匹配片段,分析了外显子连接序列上的匹配频率分布和匹配片段的序列特征。发现一些低等真核生物EJC结合区域的匹配频率明显低于其它区域,所有物种EJC结合区域的序列构成呈现出相对低的结构序。最佳匹配片段的平均长度和配对率分布与siRNA和miRNA的结合特征相同。推测EJC和内含子在与外显子序列结合的过程中存在相互竞争和相互协作的关系,内含子中部序列在基因表达调控过程中起着重要的作用。     

鳜类系统发育的线粒体Cytb基因全序列分析

测定了鳜、大眼鳜、斑鳜、暗鳜、波纹鳜、长体鳜、中国少鳞鳜等7种鳜类12个个体的线粒体细胞色素b基因全序列。结合GenBank中的同源序列,共分析了9种鳜类的系统发育关系。序列分析表明,鳜属鱼类属内种间的遗传距离(0.015～0.093)明显小于少鳞鳜属鱼类属内种间的遗传距离(0.152～0.178)。在分子系统发育树上,长体鳜与鳜属的鳜、大眼鳜、斑鳜、波纹鳜、暗鳜聚合成一分支,少鳞鳜属的种类聚成另一分支;支持将长体鳜归入鳜属,鳜类分为鳜属和少鳞鳜属等二个属的分类处理。在鳜属鱼类中,鳜和大眼鳜亲缘关系十分密切;斑鳜与波纹鳜亲缘较近;长体鳜与鳜属其它5个种的亲缘关系较远。在少鳞鳜属鱼类中,中国少鳞鳜和日本少鳞鳜的亲缘关系较远,韩国少鳞鳜的系统位置较不明确。鳜类的单系性及其鳜类的系统位置仍有待进一步研究。     

一个锂品种线粒体基因片段序列保守性

在红锂、镜锂和野锂中进行线粒体１６rRNA和Ｃytb基因片段的序列测定。结果发现,３个鲤品种在多达８５９个碱基长度上无变异,但是与已报道的鲤全序列中的同源序列则有约１．５％的趋异。这个结果提示３个鲤品种可能在起源中是独立的一支。并且分化极低。     

池蝶蚌线粒体基因组全序列分析

采用普通PCR扩增、SHOT-GUN测序、软件拼接首次获得了池蝶蚌（Hyriopsis schlegelii）线粒体基因组全序列。线粒体基因组全长为15939 bp,由13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个SrRNA基因和28个长度为1393 bp的非编码区组成;除ND3-ND5、ND4L、ATP6、ATP8、COX1-COX3、tRNA-D、tRNA-H之外,其他大多数基因在L链编码。池蝶蚌线粒体全基因组序列、蛋白编码基因、tRNA基因、rRNA基因及非编码区的A+T含量分别为60.36%、59.84%、61.7%、60.23%及62.5%,与其他淡水蚌类一致,均表现出A+T偏好性,淡水蚌类线粒体基因组长度的差异主要表现在非编码区长度的差异。池蝶蚌mtDNA的COX2-12SrRNA区域基因排列存在差异,是ND3、tRNAHis、tRNAAla、tRNASer1、tRNASer2、tRNAGlu、ND2、tRNAMet 8个基因发生重组造成。22个tRNA基因都具有典型的三叶草二级结构,tRNA-E与 tRNA-W间的非编码区含有一个ORF区,而控制区并未发现。从GenBank上下载的14种双壳纲贝类的mtDNA序列构建的系统进化树,显示池蝶蚌与三角帆蚌亲缘关系最近。研究结果为淡水珍珠蚌线粒体基因重排及进化特征提供理论依据。       

乌龟线粒体全基因组序列和结构分析

龟鳖类同其它类群脊椎动物的系统进化关系一直存在争论。为进一步从分子水平上探讨这一问题,本文参照近源物种的线粒体基因组,设计了16对特异引物,采用PCR产物直接测序法测得了乌龟线粒体基因组全序列。结果表明:乌龟线粒体基因组序列全长16576bp,包括2个rRNA基因、22个tRNA基因、13个蛋白质编码基因和1个非编码控制区。乌龟线粒体基因组结构和基因排列顺序与其它龟鳖类相同,在“WANCY区”包含一个“stemloop”结构,ND3基因174位点存在一个额外插入的腺苷酸(A)。本文通过比较分析结构基因在主要脊椎动物类群中的排列顺序,探讨了龟鳖类与其它主要脊椎动物类群的系统进化关系     

兰州鲇线粒体Cytb基因的克隆与序列分析

为克隆兰州鲇（Silurus lanzhouensis）线粒体Cytb基因全序列,根据欧洲鲇（Silurus glanis）线粒体基因全序列设计特异引物进行兰州鲇线粒体Cytb基因的PCR扩增,得到1138 bp兰州鲇线粒体Cytb基因序列。对兰州鲇和其他13种鱼的线粒体Cytb基因核苷酸和氨基酸序列之间进行同源性比较,结果显示具有较高的同源性,核苷酸同源性介于61.38%-91.12%,氨基酸同源性介于76.62%-95.52%。对兰州鲇、欧洲鲇、大口鲇（Silurus meridionalis）、鲇（Silurus asotus）、越南鲇（Silurus cochinchinensis）的Cytb基因之间进行碱基替代分析,结果显示兰州鲇Cytb基因与鲇之间替换率最低,值为8.87%,转换/颠换值为3.21;与越南鲇之间替换率最高,值为14.41%,转换/颠换值为1.83。对本文克隆的兰州鲇Cytb基因与王庆容等测定的兰州鲇线粒体Cytb序列进行序列差异分析,结果显示两者之间替换率为11.16%,存在127个变异位点,转换/颠换比为4.08,遗传距离为0.1230。由NJ法基于兰州鲇和其他13种鱼的Cytb基因序列构建的系统进化树,结果显示与传统的分类地位基本吻合。       

银环蛇线粒体基因组全序列分析

根据GenBank公布的蛇类物种线粒体基因序列和已知的引物序列,总共设计和合成了9对引物.采用保真度较高的Ex-Taq酶,以总基因组DNA为模板进行PCR扩增,产物纯化后进行TA克隆和步移测序,拼接后获得了全长17 144 bp银环蛇线粒体基因组全序列.其共编码13种蛋白质、2种rRNA和22种tRNA.这些基因没有内含子,基因间排列紧密,仅有极少或完全没有核苷酸,甚至相互重叠.除了含有2个调控线粒体基因组复制和转录的控制区外,其余基因在长度和位置等方面与其它脊椎动物均具有较高的同源性.     

三种海豚线粒体COI基因的序列分析

对瓶鼻海豚(Tursiops truncatus)、中华白海豚(Sousa chinensis)和糙齿海豚(Steno bredanensis)的线粒体DNA COI基因进行了测序分析。PCR产物约700bp。扩增产物直接测序,去除引物序列后分别获得643、618和618bp的核苷酸序列。碱基组成平均为,T:31·07%,C:26·13%,A:27·27%,G:15·50%,GC含量为41·63%,其中碱基G的含量明显较低。与Gen Bank中9种鲸的同源序列比对,去除部分端部序列后得到597个比对位点,包括141个简约信息位点,43个单突变子,无插入/缺失位点。12种鲸的种间序列差异较大,其序列变异度在2·1%～17·1%之间。597个比对位点编码199个氨基酸,其中有9个氨基酸发生改变,其中一个氨基酸突变可将齿鲸亚目和须鲸亚目分开。NJ系统树表明,海豚科形成单系类群,瓶鼻海豚和中华白海豚的亲缘关系较近。上述分析表明,COI基因可用于鲸类的种类鉴定和系统发育分析。     

中华鳖线粒体基因组序列分析

参照近源物种线粒体基因组序列,设计17对特异引物,采用PCR产物直接测序法测得中华鳖线粒体基因组全序列.初步分析其基因组特点和各基因的定位,用pDRAW32软件预测12种限制性酶对其的酶切图谱.结果表明,中华鳖线粒体基因组全长17364bp,核苷酸组成为35.23%A、27.26%T、25.73%C、11.78%G,包括13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和1个非编码控制区.基于线粒体基因组编码的13个蛋白质的氨基酸序列,用NJ法和MP法构建系统进化树,分析6种龟鳖类动物之间的亲缘关系,与传统的系统分类基本一致,初步确定淡水龟科与海龟科的亲缘关系比与龟科的亲缘关系要近.     

鲫鱼生长激素Ⅰ基因内含子2的多态性分析

利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Denaturing-Polyacrylamid Gel Electrophoresis,DPAGE)和单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymorphism,SSCP)分析技术,在普通鲫鱼种群(7个野生鲫鱼群体和2个金鱼群体)和银鲫种群(1个方正银鲫群体)共162个个体生长激素Ⅰ(Growth HormoneⅠ,GHⅠ)基因的内含子2中检测到丰富的长度和序列多态性。在所有群体中,GHⅠ基因内含子2的长度存在7种类型,分别为A、B、c、D、E、F和G型,变异频率为4．32％;其序列存在15种单倍型,分别为Al、A2、A3、B、c1、C2、Dl、D2、D3、D4、D5、E1、E2、F和G型,变异频率为9．26%。对这15种单倍型的DNA序列进行分析,结果表明：1)鲫鱼GHⅠ基因内含子2的扩增DNA片段长为243～263bp,其中包括部分外显子2(3’端,33bp)、内含子2和部分外显子3(5’端,2lbp)。15种单倍型A、T、G、C碱基平均百分比组成分别为34．13％、37．36％、15．130A,、13．38％,其中G C(28．5l％)含量明显小于A T(71．49%)含量。内含子2与外显子2、3的接头区存在GT-AG保守序列,此为真核基因中mRNA剪接的识别信号。内含子2的5’端存在有一序列为GTAAGAT的保守区域,在其近3’端分布有一高丰度嘧啶区;2)内含子2的7种长度类型A、B、C、D、E、F和G型分别为189、196、204、205、206、207和209bp,其差异主要由单碱基T重复次数N不同(Ⅳ：0、8、9、10、11和13)和3种序列(TGAAAAC、TT和GAGTG)中1种或2种序列的缺失所引起;3)内含子2的15种单倍型的核苷酸序列中共有17个突变位点,包括2个碱基颠换突变位点和15个碱基转换突变位点,碱基转换突变频率为88．24％,明显高于颠换突变频率(11．76％)。普通鲫鱼种群中金鱼群体D11b、Dhr的GHⅠ基因内含子2均为长度类型A,含有两种序列单倍型(以下简称单倍型)即A1和A2;野生鲫鱼群体的内含子长度和序列变异较大,检测到A、B、C、D、E、F、G7种长度类型和14种单倍型(A1、A2、A3、B、C1、C2、D1、D2、D3、D4、E1、E2、F和G型)。在银鲫种群CaG中检测到c和D两种长度类型和4种序列单倍型(C1、C2、D2和D5),其中D5仅在此种群中检测到。     

鳙的线粒体基因组核苷酸全序列分析

对采集自我国长江的鳙的线粒体DNA全序列进行了测定.结果表明,鳙的线粒体DNA全长为166221 bp,其碱基因组成为A=31.6%;C=27.1%;G=16.0%;T=25.3%,A+T含量为56.9%.鳙线粒体基因组的排列、结构和组成与其它鲤科鱼类相似,包括37个基因,即13个蛋白质编码基因,2个rRNA基因,22个tRNA基因和一个非编码控制区(D-loop).在13个蛋白编码基因中,除ND6由轻链编码外,其余12个基因均由重链编码.COI基因的起始密码子为GTG,而其它12个蛋白编码基因的起始密码子均为ATG.     

一种石磺科贝类线粒体基因组全序列分析

石磺线粒体基因组全序列对研究石磺科分子系统进化具有重要意义。利用LA-PCR技术对一种石磺Platevin-dexmortoni线粒体基因组全序列进行了测定和分析。结果表明,线粒体基因组序列全长13 991 bp,碱基组成分别为27.27%A、16.78%C、20.23%G、35.72%T;由22个tRNA、2个rRNA、13个蛋白编码基因和25个长度为2-118 bp的非编码区组成。4个蛋白质编码基因和5个tRNA基因从L链编码,其余基因均从H链编码。蛋白质基因的起始密码子,除ND2为GTG以外,均为典型的起始密码子ATN。ND2和Cytb基因使用了不完全终止密码子T,其余基因均使用典型的TAA或TAG。预测了22个tRNA基因的二级结构,发现tRNASer和TrnaAsn缺少DHU臂,tRNASer和tRNAThr的反密码子环上有9个碱基,而不是通常的7个碱基。最长的非编码区含有两个类似于的tRNAGln和tRNAPhy的二级结构。     

家蚕线粒体ND2、COⅠ和若干tRNA基因的克隆及序列分析

克隆并测定了家蚕（Bombyx mori）线粒体基因组3468bp的EcoRⅠ和HindⅢ双酶一段序列,根据序列同源性比较,该DNA片段包括3个蛋白质编码基因：ND2基因、COⅠ基因和COⅡ基因5′端399bp的序列,以及6个tRNA基因和一个尚待确定的tRNA^Met基因。家蚕与果蝇的ND2基因序列同源性约69.7%,COⅠ基因的同源性约83.8%,COⅡ基因5′端的同源性约80％,这表明细胞色素氧化酶基因在物种间比烟酰胺腺漂呤二核苷酸脱氢酶基因保守,6个推定的tRNA基因序列与果蝇相应tRNA基因序列差异较大,另外,除tRNA^Chn基因的二级结构相似外,其它tRNA基因的二级结构与果蝇相应tRNA基因的二级结构也有较大差异。     

短尾蝮蛇线粒体基因组全序列分析

参照近缘物种的线粒体基因序列设计并筛选得到8对引物,结合TA克隆和步移测序获得了全长17227bp的短尾蝮蛇线粒体基因组全序列.与多数蛇类线粒体基因组类似,其共编码包括13个蛋白、2个rRNA和22个tRNA在内的37个基因,另外还包含2个非编码的富含AT的控制区.基因间排列紧凑,多数基因间间隔极短甚至发生重叠.除nad1、cox1和nad3外,多数蛋白编码基因均以ATG作为起始密码子,终止密码子的使用则存在TAA、AGA、AGG和不完全的T4种情况.基于合并的19个tRNA基因序列组合数据采用NJ、MP和ME3种算法对21种蛇进行了初步的系统发育分析,结果表明,各主要分类单元之间的亲缘关系与前人基于形态学、线粒体12SrRNA和cytb基因序列研究的结论完全一致,这证实了基于合并的线粒体tRNA基因序列进行蛇类物种DNA分子系统学研究的可行性.     

番茄抗病基因Cf9的3′UTR区含有内含子序列

从番茄（ＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍＭｉｌ．）抗病品种“中杂９号”基因组ＤＮＡ中扩增并克隆了番茄抗叶霉病基因Ｃｆ９。序列分析结果表明,该基因全长２７５１ｂｐ,含有一个编码８６３个氨基酸的开放阅读框架。在该基因的３′ＵＴＲ区发现了一段未曾报道的内含子序列,长１１５ｂｐ,它所处的位置与番茄另一个抗叶霉病基因Ｃｆ２内含子的位置相似,其５′和３′边界序列为一重复序列,ＴＣＣＡＧＧ（Ｔ）ＡＴＴＣ,并与Ｃｆ２基因内含子边界序列高度同源。与已报道的Ｃｆ９的ｃＤＮＡ序列相比,它的第３７１位的核苷酸Ｔ突变成了Ｃ,从而使其编码蛋白的ＬＲＲ区第１２１位的亮氨酸突变为脯氨酸。     

背瘤丽蚌F型线粒体基因组全序列分析

部分双壳贝类的线粒体遗传方式是特殊的双重单亲遗传方式:F型存在于雌性体细胞组织和性腺中,M型仅存在于雄性个体的性腺中。通过LA-PCR扩增、SHOT-GUN测序、软件拼接获得背瘤丽蚌(Lamprotula leai)F型线粒体基因组全序列。线粒体基因组全长为16530 bp,包括13个蛋白质编码基因,22个tRNA其中包括2个tRNA^Ser和2个tRNA^Leu,2个SrRNA及27个长度不等的非编码区,最长的两个非编码区分别为969 bp、228 bp。比较分析已登录到GenBank中的淡水蚌类F型线粒体结构特征,结果显示背瘤丽蚌F型A+T含量为60.28%,表现出A+T偏好性,淡水蚌类线粒体基因组长度的差异主要表现为非编码区长度的差异。此外,背瘤丽蚌mtDNA的COⅡ-12S rRNA区域基因排列存在差异,是ND3、tRNA^His、tRNA^Ala、tRNA^Ser1、tRNA^Ser2、tRNA^Glu、ND2、tRNA^Met 8个基因发生重排造成。F型线粒体序列构建的系统进化树中,淡水蚌类和海水双壳贝类分别聚为一支。研究结果为进一步研究淡水珍珠蚌的DUI线粒体遗传方式和种质资源保护奠定基础,为双壳贝类mtDNA基因重排提供依据。     

线粒体nad1基因内含子在稻族系统学研究中的价值——兼论Porteresia的系统位置

在植物的系统与进化研究中,相对于叶绿体和核基因片段来说,线粒体基因片段由于其分辨率较低、结构复杂而较少应用到系统学研究中。本研究选用nad1基因的第2内含子序列探讨了稻族Oryzeae的系统发育关系,并着重分析了单型属Porteresia的系统学位置,并在此基础上探讨了nad1基因内含子序列的系统学意义以及空位性状在系统发育重建中的价值。本研究结果支持将稻族分为两个亚族（Oryzinae和Zizaniinae）的处理,稻族中假稻属Leersia与稻属Oryza最近缘,Porteresia coarctata不应该单独成属而应处理为稻属的成员。本研究表明,nad1第2内含子具有一定的系统发育信息,尤其是在较高分类等级的系统发育重建中具有较大价值;同时表明空位的合理利用将在已有序列信息基础上提供更多的系统发育信息。     

mRNA序列与相应内含子序列匹配的普适性分析

剪切后的内含子在基因表达和调控过程中发挥重要作用,由此在成熟mRNA与相应的内含子之间也存在相互作用,并且二者协同进化。为了验证这一理论,以13个物种的基因组作为研究样本,凭借Smith-Waterman的局域比对方法,最终得到在成熟mRNA与其内含子序列之间的最佳匹配片段,同时在mRNA序列上显示出最佳匹配强度的分布区。然后对最佳匹配片段的长度、配对率的分布这两项参数进行分析之后,发现最佳匹配片段的这两个参数的特征,与siRNA和miRNA的结合特征是相近的;在mRNA序列上,得出UTR区与内含子相互作用强,GC含量低的片段偏好结合到3’UTR区,相反GC含量高的片段更倾向与5’UTR区发生相互作用。因此,最佳匹配片段的序列特征符合RNA-RNA相互作用规律,可以把内含子看成是一种具有基因表达调控功能的序列。以上研究对于进一步探讨内含子的功能和进化具有重大意义。