栗疫菌低毒力dsRNA与真菌病毒dsRNA的序列同源性

以我国栗疫菌［Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ（＝Ｅｎｄｏｔｈｉａ）ｐａｒａｓｉｔｉｃａ］低毒力菌株ＥｐＣ１４０（广西）的［γ─￣３２Ｐ］ＡＴＰ末端标记ｄｓＲＮＡ作探针,与５种真菌病毒ｄｓＲＮＡ进行分子杂交。探针可与紫孢侧耳病毒（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓｓｅｐｉｄｕｓｖｉｕｓ）和小麦全蚀菌病毒（Ｇａｅｕｍａｎ─ｎｏｍｙｃｅｓｇｒａｍｉｎｉｓ·ｖｉｒｕｓ）的ｄｓＲＮＡ杂交,但不能与黑曲霉病毒（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒｖｉｒｕｓ）、产黄青霉病毒（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍｖｉｒｕｓ）和稻瘟菌病毒（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａｏｒｙｚａｅｖｉｒｕｓ）的ｄｓＲＮＡ杂交。当以低毒力菌株ＥｐＣ３２（云南）作探针时,结果相同。     

栗疫菌低毒力菌株dsRNA的分离及转移

自云南、广西、江苏、浙江、河北、京郊六个省市的板栗树(Castanea mollissima)溃疡斑上分离了栗疫菌(Endothia parasitica)160株,进行了dsRNA的提取及其毒力测定,获得两株含dsRNA的低毒力菌株(H),其毒力与带有起源于欧洲的dsRNA的低毒力菌株比较相近。比较国内菌株与欧洲低毒力菌株的dsRNA电泳谱带,示有共同分子量为5x106或6．2 x 108的电泳带。与正常毒力菌株(V)混合接种能显著降低致病力。这是欧美大陆发现低毒力菌株后,亚洲地区的首次报告。以5株具有欧洲dsRNA的低毒力菌株作为供体,与云南、江苏、浙江的10株毒力菌株配对,16％(8,50)的毒力菌株发生形态变化,dsRNA转入后毒力明显降低。结果表明,国内毒力菌株可以接受欧洲低毒力因子——dsRNA并转变为低毒力菌株。     

我国和欧美洲栗疫菌低毒株dsRNA同源性比较

在发现我国栗疫苗(Cryphonectria parasitica=Endothia parasitica)含dsRNA低毒力菌株基础上,分别以国内菌株EpC140和EpC32、欧洲低毒株Ep713的dsRNA为探针,同欧洲、美洲及亚洲低毒力菌株dsRNA进行分子杂交,结果表明亚洲株同欧洲株之间有序列同源性,同美洲株之间无序列同源性.     

栗疫病菌群体的遗传结构

采用聚丙烯酰胺凝胶是泳方法,从栗疫病菌Ｃｒｙｈｏｎｅｃｔｒｉａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ的１８种酶体系中筛选到９种分辩率高的同工酶。对同工酶的结果表明,在中国的北京、辽宁、江西、福建汲意大利,美国、日本共７个各体的１１５个栗疫病菌菌株中,多酚氧化酶（ＰＰＯ）,过氧化物酶（ＰＯＸ）、细胞色素氧化酶（ＣＣＯ）、乙醇脱氢酶（ＡＤＨ）,超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）单态性;α－酯酶（α－ＥＳＴ）β－酯酶（β－ＥＳＴ     

栗疫病菌不同毒力菌株胞外酶活性和草酸产量的比较

对栗疫病菌不同毒力菌株产生胞外酶的种类、活性和草酸产量以及草酸对多聚半乳糖醛酸酶水解聚果胶酸钙的影响进行了研究。所有供试菌株均未能检测到淀粉酶活性。栗疫病菌在培养中可分泌漆酶,多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、纤维素酶和脂酶,但不同毒力菌株产生这些酶的能力不同。总的来说,强毒力菌株均可分泌这些酶,且活性强,但弱毒力菌株的酶活性较弱或不分泌这些酶。菌丝产量和草酸产量分析表明,强毒力菌株的草酸产量明显高于弱毒力菌株。菌丝产量与草酸产量没有相关性。在没有草酸盐存在的条件下,多聚半乳糖醛酸酶不能降解聚果胶酸钙。     

中国东部栗疫病菌dsRNA群体的多样性

采用生物学测定和凝胶电泳的方法,对中国东部栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)的dsRNA病毒进行了研究。根据电泳图谱,中国东部栗疫病菌的dsRNA病毒可以分为5种类型,其中类型1只具有一个12．7kh的条带,占大多数;类型Ⅱ有两条带,一条12．7kh,另一条5．2kb左右,只有一个菌株354;类型Ⅲ则除了12．7kb的条带外,还有3条小于2kb的小片段,有238和250两个菌株;dsRNA属于类型Ⅳ的为269和344两个菌株,它只含有两个1．8—3．1kb的小片段;dsRNA类型Ⅴ只有一个菌株280,除了一条12．7kb分子外,还有4条2．6—3．3kb的小片段。含有dsRNA的菌株培养性状多样,根据菌落特征．栗疫病菌可以划分为5种培养类型,但菌株的培养类型与dsRNA的类型间没有对应的关系。毒力测定表明含有dsRNA病毒的供试菌株大多属于低毒力类型;     

栗疫病菌群体的遗传结构

采用聚丙烯酸胺凝胶电泳方法,从栗疫病菌Cryphonectriaparasitica的18种酶体系中筛选到9种分辨率高的同工酶。对同工酶的检测结果表明,在中国的北京、辽宁、江西、福建及意大利、美国、日本共7个群体的115个栗疫病菌菌株中,多酚氧化酶（PPO）、过氧化物酶（POX）、细胞色素氧化酶（CCO）、乙醇脱氢酶（ADH）、超氧化物歧化酶（SOD）为单态性;α-酯酶（α－EST）、β-酯酶（β-EST）、苹果酸脱氢酶（MDH）、苹果酸酶（ME）为多态性,分别具有10、7、3、3种电泳表现型。通过9种同工酶的凝胶电泳分析,对栗疫病菌的群体结构进行了比较。中国地区4个群体间的遗传相似性较大,与美国、意大利、日本群体间的相似性较小;美国、意大利群体间的遗传相似性较大,且它们与日本群体间的相似性大于与中国各群体间的相似性,这一结果表明美国的栗疫苗可能是从日本传人的。病菌群体的遗传变异率为of60,其中83．1％由群体内的变异引起,16．9％由群体间的差异引起。群体间的基因流动值为246。     

栗疫病菌低毒性病毒(CHV1)分子序列的多态性

为了探明欧洲栗疫病菌低毒性病毒(CHV1)病毒的起源,采用序列测定方法对来自中国、日本和意大利的30个CHV1的遗传多样性进行了分析。测定了所有病毒的部分序列,根据测序结果可将其分为29个单元型,分属于3个不同的亚型:中国菌株的病毒群体归属于亚型Ⅰ和Ⅲ;日本病毒群体除Ja55属于亚型Ⅲ外,其余属于亚型Ⅱ;意大利病毒群体除IT192属于亚型Ⅰ外,其余都属于亚型Ⅲ。中国CHV1病毒群体的地理分布特点为:亚型Ⅰ主要分布在长江以北,其中只有09344(来自湖南)例外;而亚型Ⅲ主要分布在长江以南,但09228(北京)、09235(北京)、09277(辽宁)例外。这不同于欧洲主要以一种亚型为主的情况,表明各群体之间存在着一定的基因流动。本研究的结果表明中国CHV1病毒群体的遗传多样性比日本群体和意大利群体都丰富。     

栗疫病菌的营养体亲和性基因和dsRNAs对病毒传播的影响

研究了栗疫病菌（Ｃｒｐｈｏｎｅｃｔｒｉａｐａｒａｓｉｔｉｃａ（Ｍｕｒｒ）．Ｂａｒｒ）营养体亲和性基因及ｄｓＲＮＡ病毒对菌株间病毒特征与传播影响,试验选用已知４个ＶＣ基因座位的１５个ＶＣ基因型菌株和３种ｄｓＲＮＡ病毒,通过含病毒菌株与野生型菌株的配对培养,将病毒逐个转入不同ＶＣ基因型菌株,将不同ＶＣ基因型的含病毒菌株与具特定ＶＣ基因差异的野生型菌株配对培养,根据培养两周后野生型菌株培养性状的改变与否     

香菇dsRNA病毒LeV的RT-PCR检测

香菇病毒HKB(Lentinula edodes mycovirus HKB,LeV)是一种具有潜隐性特点的真菌病毒,广泛存在于香菇菌株中。为了快速、准确地检测出LeV,根据LeV病毒基因组序列(AB.429556.2)的信息,设计合成一对引物,对25个香菇菌株进行RTPCR检测,在20个香菇菌株中分别扩增出LeV病毒基因组特有的条带,在5个香菇菌株中未能扩增出条带。通过对25个香菇菌株进行dsRNA提取检测,结果也表明不存在扩增片段的菌株提取不到dsRNA,存在扩增片段的菌株能够提取得到dsRNA。因此建立的RT-PCR方法可以快速检测到香菇dsRNA病毒LeV,能够对香菇的质量检测提供技术支持。     

中国东部栗疫病菌群体的遗传分化

本实验采用ＲＦＬＰ技术,对中国东部栗疫病菌进行了群体遗传结构的研究,３１３个参试菌株来自１０个省（市）的１６个群体（子群体）,样本人布在北纬２４°Ｎ－４１°Ｎ。各菌株的ＤＮＡ分别用限制性内切酶Ｐｓｔ Ⅰ和ＥｃｏＲⅠ酶切,先后以１０个低拷贝ＤＮＡ探针和１个ＤＮＡ指纹图谱探针进行了杂交和检测。结果表明,两个探针的杂交图谱呈单态性,其他７个低拷贝探针的杂交图谱都呈多态性、指纹图谱探针的检测结果显示,辽宁     

栗疫病菌的营养体亲和性基因和dsRNAs对病毒传播的影响

研究了栗疫病菌[Cryphonectria parasitica(Murr.)Barr]的营养体亲和性基因及dsRNA病毒对菌株间病毒特征传播的影响。试验选用已知4个VC基因座位的15个Vc基因型菌株和3种dsRNA病毒,通过含病毒菌株与野生型菌株的配对培养,将病毒逐个转入不同Vc基因型菌株。将不同Vc基因型的含病毒菌株与具特定VC基因差异的野生型菌株配对培养,根据培养两周后野生型菌株培养性状的改变与否,统计菌株间的病毒传播率。结果表明,各个VC基因对菌株间病毒传播的影响不同;存在2个VC基因差异的菌株间病毒传播率低于相差1个VC基因的：病毒在相差1个VC基因的菌株间的传播多具单向性：不同类型的病毒在菌株间的传播率也有差异。     

中国东部栗疫病菌群体的遗传分化

本实验采用RFLP技术,对中国东部栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)进行了群体遗传结构的研究。313个参试菌株来自10个省(市)的16个群体(子群体),样本分布在北纬24°N—41°N。各菌株的DNA分别用限制性内切酶Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切,先后以10个低拷贝DNA探针和1个DNA指纹图谱探针进行了杂交和检测。结果表明,两个探针(pCB29和pMS29.1)的杂交图谱呈单态性;探针pCB19的杂交图谱显示,菌株DNA以PstⅠ酶切的为单态性,以EcoR Ⅰ酶切的则呈多态性;其他7个低拷贝探针的杂交图谱都呈多态性(Pst Ⅰ酶切)、指纹图谱探针的检测结果显示,辽宁凤城群体的菌株与中国东部其他群体的菌株相比,具有更多的限制性杂交片段,菌株间的遗传变异性也更大。     

中国栗疫病菌群体遗传结构的空间自相关性分析

应用空间自相关分析方法对中国栗疫病菌17个居群RAPD遗传变异的空间结构进行研究,以探讨栗疫病菌居群遗传变异的分布特征及其形成机制。结果表明：中国栗疫病菌居群缺乏空间结构,绝大多数RAPD位点变异为随机分布的空间模式,但部分位点表现出渐变、斑块和双向渐变的非随机分布模式,又显示了一定的空间结构。推测其形成原因可能是长距离的基因流、人类活动、地理隔离以及栗疫病菌本身的繁殖特性综合作用的结果,并依据部分位点呈单向渐变的模式推测西南地区为中国栗疫病菌的起源中心。     

家蚕质多角体病毒(BmCPV)基因组dsRNA片段V的全序列测定

质多角体病毒属于呼肠孤病毒科质多角体病毒属,代表种为家蚕质多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV).质多角体病毒粒子为正二十面体,直径约60nm～80nm,正二十面体的十二个顶点均有管状突起.     

绿僵菌及其与dsRNA混合使用对褐飞虱的防治效果

褐飞虱Nilaparvata lugens Stl是我国重要的迁飞性水稻害虫,本文研究了金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae及其与dsRNA混合使用对褐飞虱的防治效果。绿僵菌悬浮液1.6×108孢子/m L至8×106孢子/m L对褐飞虱2龄、4龄和成虫进行喷药,发现1.6×107孢子/m L对各个虫态虫龄均有良好致死效果,并且成虫和4龄若虫均好于2龄若虫。在交配行为上来看,绿僵菌处理过的褐飞虱成虫活跃度非常低,从配对开始一直到交配结束的各个阶段都受到明显影响,处理组3 h的交配率只有3.70%,而对照组的交配率为24.44%。还把褐飞虱几丁质合成酶基因A的dsRNA与绿僵菌混合使用防治褐飞虱2龄和4龄若虫,结果表明0.5μg/μL ds CHSA与绿僵菌混合使用的防治效果最好,2龄若虫的死亡率为89.63%,4龄若虫的死亡率达到93.94%。而0.2μg/μL ds CHSA与绿僵菌的混合,对2龄和4龄若虫的致死率为65.56%-76.52%。研究结果为褐飞虱的生物防治提供了新的思路。     

低毒病毒及板栗疫病菌低毒力机制

低毒病毒是一类存在于板栗疫病菌细胞质中自主复制的无衣壳正链RNA病毒.感染低毒病毒后,板栗疫病菌的致病力显著降低,色素分泌减少,菌丝体由感染病毒前的桔黄色变为白色,产孢量降低或不产孢,漆酶表达水平明显下降.低毒病毒侵染性克隆的获得以及高效转化和转染体系的建立,使得低毒病毒成为目前唯一可以进行全面遗传操作的真菌病毒.利用低毒病毒作为探针来探测板栗疫病菌的致病力组成和毒力调节机制,已获得了一些很有意义的发现.本文介绍近几年低毒病毒及其与真菌相互作用的研究进展,包括低毒病毒的基因组和功能基因研究、低毒病毒和线粒体损害引起的板栗疫病菌低毒力机制、板栗疫病菌的RNA沉默系统以及低毒病毒抗RNA沉默的机制.低毒病毒/板栗疫病菌系统已经成为研究病毒与宿主相互作用以及病原真菌致病机理的很好的模式系统.     

美完成稻瘟病菌基因组序列检测

AgBiotech Reporter2005年22卷6期8页报道：美国北卡罗来纳州立大学植物病理学家Ralph Dean经过为期7年的努力,已测定了稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的基因组序列。已知稻瘟病菌是严重危害湿热地区国家。例如泰国和菲律宾水稻的病原真菌。