用逆转录病毒载体表达人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子

应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒（ＣＭＶ）启动子的基因片段和人粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）的ｃＤＮＡ,克隆进逆转录病毒载体Ｎ２Ａ,得到重组质粒Ｎ２Ａ／ＣＭＶ／ｈＧＭ－ＣＳＦ．经脂质体包装并转染包装细胞,通过Ｇ４１８药物筛选,得到抗性克隆。经ＰＣＲ和Ｓｏｕｔｈｅｍｂｌｏｔ检测证实,ＧＭ－ＣＳＦ基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达１０￣４ＣＦＵ／ｍｌ,克隆细胞培养上清用ＴＦ－１细胞可检测到ＧＭ－ＣＳＦ活性。     

逆转录病毒介导CD基因在人结肠癌细胞中表达

构建了含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因（ＥＣ－ＣＤ）的重组逆转录病毒载体ＬＣＤＤＳＮ。经ＰＡ３１７细胞包装后,感染人结肠癌细胞株ＬｏＶｏ。Ｇ４１８筛选得一的稳定表达ＥＣ－ＣＤ基因的细胞克隆ＬｏＶｏ／ＬＣＤＳＮ。ＬｏＶｏ／ＬＣＤＳＮ鹜型ＬｏＶｏ相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变。ＬｏＶｏ／ＬＣＤＳＮ都对５－ＦＵ很敏感（ＩＣ５０约为０．５μｍｏｌ／Ｌ）。表达ＣＤ基因使细胞对基本无毒性的原药５－ＦＣ     

优化mRNA翻译起始区提高人粒－巨噬细胞集落刺激因子在E．coli中的表达

人粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）是一种重要的造血生长因子．利用基因重组技术构建两个ｈＧＭ－ＣＳＦ的Ｅ．ｃｏｌｉ表达菌株,一个为在不改变氨基酸顺序的前提下,对ｍＲＮＡ翻译起始区核苷酸顺序进行优化突变（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ））,另一个为未突变的对照（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ））．经酶切电泳、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ等分析鉴定,证明两者均能表达特异性的１４．６ｋＤｈＧＭ－ＣＳＦ,但ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ）的表达水平较ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ）提高了１．２６倍,占菌体总蛋白的１６．９％．ｍＲＮＡ翻译起始区二级结构预测分析表明,优化突变后生成自由能ΔＧ从原来的－１０．２提高至－９．４Ｋｃａｌ,ＡＵＧ从部分配对状态变为非配对状态．     

重组人GM—CSF基因在昆虫细胞中的表达

利用苜蓿夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）带β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ基因标记的非融合蛋白基因转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃ将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）基因成功地插入病毒ＡｃＮＰＶ的基因组中．ｈＧＭ－ＣＳＦ基因在感染重组病毒的草地夜蛾（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）培养细胞Ｓｆ９中得到表达,感染后的Ｓｆ９细胞培养液能刺激人骨髓细胞在体外形成典型的集落,表达水平可达２．７×１０５５ＣＦＵ／ｍｌ。以ｈＧＭ－ＣＳＦ单抗所作的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ表明,表达的ｈＧＭ－ＣＳＦ对是３种糖基化程度不同的产物,分子量分别约为１５ｋｄ,１８ｋｄ和２０ｋｄ。     

优化mRNA翻译起始区提高人粒—巨噬细胞集落刺激因子在E.coli…

人粒－巨噬细胞集落刺激因子（ｈＧＭ－ＣＳＦ）是一种重要的造血生长因子。利用基因重组技术构建两个ｈＧＭ－ＣＳＦ的Ｅ．ｃｏｌｉ表达菌株,一个为在不改变氨基酸顺序的前提下,对ｍＲＮＡ翻译起始区核苷酸顺序进行优化突变（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｍ））,另一个为未突变的对照（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ））。经酶切电泳、ＤＮＡ测序、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ等未突变的对照（ｈＧＭ－ＣＳＦ（Ｎ））。经酶切电泳、Ｄ     

脑源性神经营养因子（BDNF）在成肌细胞中的稳定表达

将ｂｄｎｆ基因克隆入逆转录病毒载体ｐＬＮＣＸ,构建得到ｐＬＮＣ／ＢＤＮＦ,经ＰＡ３１７细胞包装后,感染大鼠成肌细胞Ｌ６ＴＧ,Ｇ４１８筛选２周后,得到稳定表达ｂｄｎｆ基因的细胞克隆Ｌ６ＴＧ／ＢＤＮＦ。ＤＮＡ印迹结果证实ｂｄｎｆ基因已经整合入Ｌ６ＴＧ染色体中,ＲＮＡ印迹和斑点印迹结果分别从ｍＲＮＡ水平和蛋白水平证明了ｂｄｎｆ基因的表达,且Ｌ６ＴＧ／ＢＤＮＦ培养上清中ＢＤＮＦ的含量约为２５ｎｇ（１０６细胞数每ｍｌ每２４ｈ）。     

逆转录病毒介导的TNFa基因在胶质瘤细胞系（C6）中的表达及对肿瘤细胞恶性生长的影响

利用逆转录病毒载体ＬＸＳＮ构建了含有完整编码ＴＮＦｃＤＮＡ的重组逆转录病毒质粒ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ,用Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ将重组质粒导入病毒包装细胞ｐＡ３１７,经Ｇ４１８筛选培养获得抗性克隆,用ＮＩＨ３Ｔ３细胞测定病毒滴度,获得滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系Ｃ６,得到Ｇ４１８抗性克隆细胞Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ,经ＰＣＲ检测,ＴＮＦｃＤＮＡ完整地整合在细胞基因组中。测定Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞上清中ＴＮＦ的生物活性,结果显示ＴＮＦ有相对稳定的表达（４８～１８０Ｕ／ｍｌ１０６ｃｅｌｌｓ／２４ｈ）。实验还显示经ＴＮＦ基因转导的Ｃ６ｐＬＸＳＮ－ｔｎｆ细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞Ｃ６明显下降,基因修饰后的肿瘤细胞在Ｗｉｓｔａｒ大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。     

转TK基因的人结肠癌细胞对多种原药敏感性的研究

构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶ－ＴＫ）的重组逆转录病毒载体ＬＴＫＳＮ,经ＰＡ３１７细胞包装后,感染人结肠癌细胞株ＬｏＶｏ．用Ｇ４１８筛选到稳定表达ＨＳＶ－ＴＫ基因的细胞克隆ＬｏＶｏ／ＬＴＫＳＮ,ＬｏＶｏ／ＬＴＫＳＮ与野生型ＬｏＶｏ细胞相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变,细胞毒试验证明ＬｏＶｏ／ＬＴＫＳＮ对ＧＣＶ的敏感性很高,半杀伤浓度ＩＣ５０为０．５μｍｏｌ／Ｌ,比野生型细胞提     

重组人MCAF／GM－CSF融合蛋白表达及其生物学活性研究

利用ＰＣＲ技术和ＤＮＡ体外重组方法,把作为导向效应细胞到靶部位的单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）进行基因融合,置于ｐＢＶ２２０载体的λＰＲＰＬ串联启动子下游,构建了ＳＤ序列与ＡＴＧ之间含有不同核苷酸组成的重组质粒ｐＭＧ０１、ｐＭＧ０２和ｐＭＧ０３。ｐＭＧ０１、ｐＭＧ０２和ｐＭＧ０３的翻译起始区都不存在稳定的二级结构,但ＤＨ５α（ｐＭＧ０２、ＤＨ５α（ｐＭＧ０３）的表达水平远远高于ＤＨ５α（ｐＭＧ０１）,ＤＨ５α（ＰＭＧ０１）几乎没有表达。表达产物经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测表明,它能分别与ＭＣＡＦ和ＧＭ－ＣＳＦ抗体发生特异反应。生物学活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性和维持ｈＧＭ－ＣＳＦ依赖的ＴＦ１细胞生长的特性,说明ＭＣＡＦ和ＧＭ－ＣＳＦ的生物学功能是相容的．     

含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体的构建及表达

利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点,连接人ＴＮＦ－α及ＩＬ－２ｃＤＮＡ和选择基因新霉素磷酸转移酶基因（ＮｅｏＲ）,使ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及ＮｅｏＲ基因均受控于病毒ＬＴＲ启动子,将这３个基因转录至同一ｍＲＮＡ,从而构建成含人ＴＮＦ－α、ＩＬ－２及ＮｅｏＲ基因多顺反子逆转录病毒载体ｐＧＣＥＮ／ＴＲＩ。在ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ介导下将其导入包装细胞ＰＡ３１７,Ｇ４１８筛选得单克隆,病毒滴度为５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ重组病毒分泌的细胞株,经ＰＣＲ证明外源基因已整合至基因组,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹显示出单一转录本。用重组病毒上清感染不同的细胞,Ｇ４１８筛选所获得的抗性克隆能不同程度地表达ＴＮＦ－α及ＩＬ－２。实验结果表明,含ＩＲＥＳ的多顺反子逆转录病毒载体能很好地在同一靶细胞中表达多个外源基因。     

Epstein-Barr病毒BNLF-1基因的克隆及其在PA317细胞中的表达

本文报道以人Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒的潜伏膜蛋白基因ＢＮＬＦ－１作为目标基因,插入至逆转录病毒载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）－ＬＭＰ及其反义载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）－ａｎｔｉ－ＬＭＰ,通过质粒ＤＮＡ的电转染和Ｇ４１８培养基筛选,然后对１０个抗性克隆进行基因整合分析,获得６个含ＭＬＶ－ＬＴＲ／ＢＮＬＦ－１融合基因的阳性克隆,采用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证明,在克隆细胞中表达了２．６ｋｂ的ｍＲＮＡ片段及相应的蛋白质分子,这是由ＢＮＬＦ－１基因的ＥＤＬ１启动子表达的产物。     

粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子／白细胞介素—3融合蛋白的表达研究

利用ＰＣＲ扩增得到粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、白细胞介素－３（ＩＬ－３）完整基因片段,将其分别克隆ｐＧＥＭ－Ｔ构建成ＧＭ－ＣＳＦ／ＩＬ－３融合蛋白基因,ＤＮＡ序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对７２ＲＮＡ聚合酶表达载体ｐＴ７ｚｚ,得到表达质粒ｐＦｕ,经转化至表达宿主Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）,在ＩＰＴＧ诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴     

重组逆转录病毒载体GTK的构建及HyTK基因转移的研究

用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因（ＨＳＶｔｋ）导入恶性肿瘤细胞,随后可应用药物９－（１,３－二羟基－丙氧基－甲基）鸟嘌呤（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ）选择性地杀死肿瘤细胞．将ＨｙＴＫ基因替换逆转录病毒载体ＧｌＮａ中的ｎｅｏ基因,构建成重组逆转录病毒载体ＧＴＫ,转染混合包装细胞（双噬性ＰＡ３１７细胞和单噬性ＧＰ＋Ｅ－８６细胞）,通过“乒乓效应”获得高滴度重组病毒．用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系Ｂ１６细胞,用ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎＢ筛选出阳性细胞克隆（ＨｙＴＫ＋）,经ＰＣＲ方法检测证明ＨｙＴＫ基因已成功地导入肿瘤细胞中,且不含可复制的辅助病毒．分别用不同浓度的ＧＣＶ作用于ＨｙＴＫ－及ＨｙＴＫ＋的Ｂ１６细胞,光镜下观察２４ｈ和４８ｈ后细胞形态及进行活细胞计数．结果表明,ＧＣＶ浓度大于０．１μｍｏｌ／Ｌ时即对Ｂ１６／ＨｙＴＫ＋细胞有显著的杀伤作用     

Epstein—Barr病毒BNLF—1基因的克隆及其在PA317细胞中？…

本文报道以人Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ病毒的潜代膜蛋白基因ＢＮＬＦ－１作为目标基因,插入至逆转录病毒载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）－ＬＭＰ及其反义载体ｐＺｉｐＮｅｏＳＶ（ｘ）－ａｎｔｉ－ＬＭＰ,通过质粒ＤＮＡ的电转染和Ｇ４１８培养基筛选,然后对１０个抗性克隆进行基因整合分析、获得６个含ＭＬＶ－ＬＴＲ／ＢＶＬＦ－１融合基因的阳性克隆,采用Ｎ     

人生长激素基因在昆虫细胞中的表达(英文)

近年发展起来的昆虫细胞－杆状病毒基因工程系统具有良好的优越性：（１）表达产量高,（２）产物的免疫原性、功能性类似于天然产物,（３）适用于悬浮及无血清培养。本实验中,将外源基因ｈＧＨ克隆至质粒ｐＶＬ１３９３,形成转移载体ｐＶＬ１３９３／ｈＧＨ（Ｆｉｇ．１＆２）。与昆虫核多角体病毒ＡｃＮＰＶ基因组ＤＮＡ共转染秋粘虫细胞Ｓｆ９（Ｆｉｇ．３）,ｐＶＬ１３９３／ｈＧＨ与ＡｃＮＰＶ基因组ＤＮＡ发生同源重组,取代多角体蛋白基因。经空斑分析纯化得到不含多角体,单一表达的重组病毒ｒＡｃＶｈＧＨ（Ｆｉｇ．４）,感染滴度达到２．０３ｘ１０８ＰＵＦ／ｍＬ。经反复实验,１０５细胞／ｍＬ感染６～７天后收获培养上清液,可得到表达量为４０μｇ／ｍＬ的ｈＧＨ蛋白（Ｆｉｇ．５,６＆７）。     

腺病毒载体介导的肝癌细胞专一性自杀基因表达

构建由肝癌细胞专一的ａｆｐ基因表达调节元件控制自杀基因ＨＳＶ－ｔｋ的穿梭质粒,将它与缺陷型腺病毒载体重组,得到ＡｄｒＡＦＰＴＫ病毒。经ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交等证实它们含ａｆｐ元件和ｔｋ基因。空斑形成试验表明病毒效价达１×１０１５ｐｆｕ／Ｌ。同时构建由ＣＭＶ启动子控制ｔｋ基因的类似载体作为对照。将这两个重组腺病毒分别感染ＡＦＰ阳性（ＨｅｐＧ２）或阴性（ＨｅＬａ,ＢＲＬ－３Ａ）细胞株（ｍ．ｏ．ｉ．＝１００）,以丙氧鸟苷（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ）处理后,用ＭＴＴ法测定杀伤细胞的效应。结果,ＡｄＣＭＶＴＫ感染这三种细胞后,ＧＣＶ半杀伤浓度分别为１．３、２、＜１μｍｏｌ／Ｌ;但是,ＡｄｒＡＦＰＴＫ感染的ＨｅＬａ和ＢＲＬ－３Ａ细胞的ＧＣＶ半杀伤浓度都＞１０００μｍｏｌ／Ｌ,而对ＨｅｐＧ２细胞只有＜１μｍｏｌ／Ｌ,表现出极高的细胞专一性。重组腺病毒ＡｄｒＡＦＰＴＫ可望用于肝癌的专一性基因治疗     

利用HSV—TK基因治疗肝癌的离体研究

利用ＤＮＡ重组技术，将ＨＳＶ－ＴＫ基因克隆至逆转录病毒载体（ＸＭ－６／ＴＫ）。经ＰＡ３１７细胞包装后，转染人肝癌细胞ＨｅｐＧ２。结果显示，ＸＭ－６／ＴＫ转染ＨｅｐＧ２细胞与野生型相比，其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物－环氧鸟苷（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ，ＧＣＶ）后，转染细胞生长受到严重抑制，细胞数量明显降低。细胞学检查证实，ＧＣＶ处理后，转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示，应用ＨＳＶ－ＴＫ基因治疗肝癌可能为一种治疗肿瘤新的方法     

重组人GM－CSF／MCAF融合蛋白抗血清的制备与鉴定

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）融合蛋白经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５和ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ两步柱层析,获得了电泳纯的ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ融合蛋白。为进一步研究其结构与功能,我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。ＤｏｔＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验表明,该抗血清效价高、特异性好,可分别与ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ、ＧＭ－ＣＳＦ和ＭＣＡＦ发生反应。     

重组人GM－CSF／MCAF融合蛋白抗血清的制备与鉴定

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）和人单核细胞趋化激活因子（ＭＣＡＦ）融合蛋白经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－７５和ＣＭ－ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ两步柱层析,获得了电泳纯的ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ融合蛋白。为进一步研究其结构与功能,我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。ＤｏｔＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ试验表明,该抗血清效价高、特异性好,可分别与ＧＭ－ＣＳＦ／ＭＣＡＦ、ＧＭ－ＣＳＦ和ＭＣＡＦ发生反应。     

低分子量硫酸葡聚糖对小鼠造血干细胞动员作用的研究

给小鼠静脉注射低分子量（＜１０￣４ｕ）硫酸葡聚糖（ＤＳ）１５ｍｇ／ｋｇ后外周血中白细胞、单个核细胞（ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｋ,ＭＮＣ）、ＣＦＵ－ＧＭ、ＢＦＵ－Ｅ和ＣＦＵ－Ｍｉｘ产率等指标出现时相性变化。给药后１ｈ开始升高,２ｈ达到高峰、分别为药前值的２．２、２．６、３．８、４．４和３．０倍,７ｈ时趋向正常。给药后２ｈ上述各类细胞在外周血中的含量随着ＤＳ的剂量增加而增加。白细胞、ＭＮＣ计数在ＤＳ１８０ｍｇ／ｋｇ时达到峰值,均为对照组的４倍。２４０ｍｇ／ｋ８时未见明显增加。不同剂量ＤＳ对各系祖细胞均有不同程度的动员作用,ＤＳ剂量１５－３０ｍｇ／ｋｇ效果最好,每升血中ＣＦＵ－ＧＭ、ＢＦＵ－Ｅ、ＣＦＵ－Ｍｉｘ的数量分别相当于对照组的５．０、１１．９和８．８倍。其峰值出现时间与白细胞、ＭＮＣ不同,表明ＤＳ对不同类型细胞的作用机制也不尽一致。经口给小鼠投以ＤＳ２４０和４８ｏｍｇ／ｋｇ后,未见外周血中白细胞、ＭＮＣ计数有显著性升高,提示对造血干细胞没有动员作用。