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1.
应用基因工程的方法,将含有巨细胞病毒(CMV)启动子的基因片段和人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的cDNA,克隆进逆转录病毒载体N2A,得到重组质粒N2A/CMV/hGM-CSF.经脂质体包装并转染包装细胞,通过G418药物筛选,得到抗性克隆。经PCR和Southemblot检测证实,GM-CSF基因已整合到该克隆细胞的染色体上,获得的逆转录病毒滴度达10 ̄4CFU/ml,克隆细胞培养上清用TF-1细胞可检测到GM-CSF活性。 相似文献
2.
逆转录病毒介导CD基因在人结肠癌细胞中表达 总被引:2,自引:1,他引:1
构建了含有大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶基因(EC-CD)的重组逆转录病毒载体LCDDSN。经PA317细胞包装后,感染人结肠癌细胞株LoVo。G418筛选得一的稳定表达EC-CD基因的细胞克隆LoVo/LCDSN。LoVo/LCDSN鹜型LoVo相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变。LoVo/LCDSN都对5-FU很敏感(IC50约为0.5μmol/L)。表达CD基因使细胞对基本无毒性的原药5-FC 相似文献
3.
人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)是一种重要的造血生长因子.利用基因重组技术构建两个hGM-CSF的E.coli表达菌株,一个为在不改变氨基酸顺序的前提下,对mRNA翻译起始区核苷酸顺序进行优化突变(hGM-CSF(M)),另一个为未突变的对照(hGM-CSF(N)).经酶切电泳、DNA测序、SDS-PAGE和Westernblot等分析鉴定,证明两者均能表达特异性的14.6kDhGM-CSF,但hGM-CSF(M)的表达水平较hGM-CSF(N)提高了1.26倍,占菌体总蛋白的16.9%.mRNA翻译起始区二级结构预测分析表明,优化突变后生成自由能ΔG从原来的-10.2提高至-9.4Kcal,AUG从部分配对状态变为非配对状态. 相似文献
4.
重组人GM—CSF基因在昆虫细胞中的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用苜蓿夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)带β-Galactosidase基因标记的非融合蛋白基因转移载体pBlueBac将人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因成功地插入病毒AcNPV的基因组中.hGM-CSF基因在感染重组病毒的草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)培养细胞Sf9中得到表达,感染后的Sf9细胞培养液能刺激人骨髓细胞在体外形成典型的集落,表达水平可达2.7×1055CFU/ml。以hGM-CSF单抗所作的WesternBlotting表明,表达的hGM-CSF对是3种糖基化程度不同的产物,分子量分别约为15kd,18kd和20kd。 相似文献
5.
优化mRNA翻译起始区提高人粒—巨噬细胞集落刺激因子在E.coli… 总被引:2,自引:0,他引:2
人粒-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)是一种重要的造血生长因子。利用基因重组技术构建两个hGM-CSF的E.coli表达菌株,一个为在不改变氨基酸顺序的前提下,对mRNA翻译起始区核苷酸顺序进行优化突变(hGM-CSF(M)),另一个为未突变的对照(hGM-CSF(N))。经酶切电泳、DNA测序、SDS-PAGE和Western blot等未突变的对照(hGM-CSF(N))。经酶切电泳、D 相似文献
6.
将bdnf基因克隆入逆转录病毒载体pLNCX,构建得到pLNC/BDNF,经PA317细胞包装后,感染大鼠成肌细胞L6TG,G418筛选2周后,得到稳定表达bdnf基因的细胞克隆L6TG/BDNF。DNA印迹结果证实bdnf基因已经整合入L6TG染色体中,RNA印迹和斑点印迹结果分别从mRNA水平和蛋白水平证明了bdnf基因的表达,且L6TG/BDNF培养上清中BDNF的含量约为25ng(106细胞数每ml每24h)。 相似文献
7.
利用逆转录病毒载体LXSN构建了含有完整编码TNFcDNA的重组逆转录病毒质粒pLXSN-tnf,用Lipofectamine将重组质粒导入病毒包装细胞pA317,经G418筛选培养获得抗性克隆,用NIH3T3细胞测定病毒滴度,获得滴度为5×105CFU/ml的细胞克隆。利用病毒上清液感染大鼠胶质瘤细胞系C6,得到G418抗性克隆细胞C6pLXSN-tnf,经PCR检测,TNFcDNA完整地整合在细胞基因组中。测定C6pLXSN-tnf细胞上清中TNF的生物活性,结果显示TNF有相对稳定的表达(48~180U/ml106cells/24h)。实验还显示经TNF基因转导的C6pLXSN-tnf细胞生长速度较之亲本肿瘤细胞C6明显下降,基因修饰后的肿瘤细胞在Wistar大鼠体内形成肿瘤的能力明显受到抑制。进一步用超离心法浓缩病毒对胶质瘤移植模型进行了体内治疗研究。 相似文献
8.
转TK基因的人结肠癌细胞对多种原药敏感性的研究 总被引:2,自引:0,他引:2
构建了含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-TK)的重组逆转录病毒载体LTKSN,经PA317细胞包装后,感染人结肠癌细胞株LoVo.用G418筛选到稳定表达HSV-TK基因的细胞克隆LoVo/LTKSN,LoVo/LTKSN与野生型LoVo细胞相比,生长曲线无明显差异,细胞形态亦无改变,细胞毒试验证明LoVo/LTKSN对GCV的敏感性很高,半杀伤浓度IC50为0.5μmol/L,比野生型细胞提 相似文献
9.
利用PCR技术和DNA体外重组方法,把作为导向效应细胞到靶部位的单核细胞趋化激活因子(MCAF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)进行基因融合,置于pBV220载体的λPRPL串联启动子下游,构建了SD序列与ATG之间含有不同核苷酸组成的重组质粒pMG01、pMG02和pMG03。pMG01、pMG02和pMG03的翻译起始区都不存在稳定的二级结构,但DH5α(pMG02、DH5α(pMG03)的表达水平远远高于DH5α(pMG01),DH5α(PMG01)几乎没有表达。表达产物经Westernblot检测表明,它能分别与MCAF和GM-CSF抗体发生特异反应。生物学活性测定表明,表达产物具有明显的单核细胞趋化活性和维持hGM-CSF依赖的TF1细胞生长的特性,说明MCAF和GM-CSF的生物学功能是相容的. 相似文献
10.
含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体的构建及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
利用脑炎心肌炎病毒和脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点,连接人TNF-α及IL-2cDNA和选择基因新霉素磷酸转移酶基因(NeoR),使TNF-α、IL-2及NeoR基因均受控于病毒LTR启动子,将这3个基因转录至同一mRNA,从而构建成含人TNF-α、IL-2及NeoR基因多顺反子逆转录病毒载体pGCEN/TRI。在LipofectAMINE介导下将其导入包装细胞PA317,G418筛选得单克隆,病毒滴度为5×105CFU/ml重组病毒分泌的细胞株,经PCR证明外源基因已整合至基因组,Northern印迹显示出单一转录本。用重组病毒上清感染不同的细胞,G418筛选所获得的抗性克隆能不同程度地表达TNF-α及IL-2。实验结果表明,含IRES的多顺反子逆转录病毒载体能很好地在同一靶细胞中表达多个外源基因。 相似文献
11.
本文报道以人Epstein-Barr病毒的潜伏膜蛋白基因BNLF-1作为目标基因,插入至逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)-LMP及其反义载体pZipNeoSV(x)-anti-LMP,通过质粒DNA的电转染和G418培养基筛选,然后对10个抗性克隆进行基因整合分析,获得6个含MLV-LTR/BNLF-1融合基因的阳性克隆,采用Northern杂交及Western印迹证明,在克隆细胞中表达了2.6kb的mRNA片段及相应的蛋白质分子,这是由BNLF-1基因的EDL1启动子表达的产物。 相似文献
12.
利用PCR扩增得到粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-3(IL-3)完整基因片段,将其分别克隆pGEM-T构建成GM-CSF/IL-3融合蛋白基因,DNA序列与设计预期一致。将得到的融合蛋白基因克隆对72RNA聚合酶表达载体pT7zz,得到表达质粒pFu,经转化至表达宿主E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下获得融合蛋白目的产物的直接表达。经SDS-PAGE电泳鉴 相似文献
13.
用逆转录病毒载体将单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSVtk)导入恶性肿瘤细胞,随后可应用药物9-(1,3-二羟基-丙氧基-甲基)鸟嘌呤(ganciclovir,GCV)选择性地杀死肿瘤细胞.将HyTK基因替换逆转录病毒载体GlNa中的neo基因,构建成重组逆转录病毒载体GTK,转染混合包装细胞(双噬性PA317细胞和单噬性GP+E-86细胞),通过“乒乓效应”获得高滴度重组病毒.用该重组病毒转染小鼠恶性黑色素瘤细胞系B16细胞,用hygromycinB筛选出阳性细胞克隆(HyTK+),经PCR方法检测证明HyTK基因已成功地导入肿瘤细胞中,且不含可复制的辅助病毒.分别用不同浓度的GCV作用于HyTK-及HyTK+的B16细胞,光镜下观察24h和48h后细胞形态及进行活细胞计数.结果表明,GCV浓度大于0.1μmol/L时即对B16/HyTK+细胞有显著的杀伤作用 相似文献
14.
本文报道以人Epstein-Barr病毒的潜代膜蛋白基因BNLF-1作为目标基因,插入至逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)的克隆位点上,由此获得重组逆转录病毒载体pZipNeoSV(x)-LMP及其反义载体pZipNeoSV(x)-anti-LMP,通过质粒DNA的电转染和G418培养基筛选,然后对10个抗性克隆进行基因整合分析、获得6个含MLV-LTR/BVLF-1融合基因的阳性克隆,采用N 相似文献
15.
近年发展起来的昆虫细胞-杆状病毒基因工程系统具有良好的优越性:(1)表达产量高,(2)产物的免疫原性、功能性类似于天然产物,(3)适用于悬浮及无血清培养。本实验中,将外源基因hGH克隆至质粒pVL1393,形成转移载体pVL1393/hGH(Fig.1&2)。与昆虫核多角体病毒AcNPV基因组DNA共转染秋粘虫细胞Sf9(Fig.3),pVL1393/hGH与AcNPV基因组DNA发生同源重组,取代多角体蛋白基因。经空斑分析纯化得到不含多角体,单一表达的重组病毒rAcVhGH(Fig.4),感染滴度达到2.03x108PUF/mL。经反复实验,105细胞/mL感染6~7天后收获培养上清液,可得到表达量为40μg/mL的hGH蛋白(Fig.5,6&7)。 相似文献
16.
腺病毒载体介导的肝癌细胞专一性自杀基因表达 总被引:5,自引:0,他引:5
构建由肝癌细胞专一的afp基因表达调节元件控制自杀基因HSV-tk的穿梭质粒,将它与缺陷型腺病毒载体重组,得到AdrAFPTK病毒。经PCR及Southern杂交等证实它们含afp元件和tk基因。空斑形成试验表明病毒效价达1×1015pfu/L。同时构建由CMV启动子控制tk基因的类似载体作为对照。将这两个重组腺病毒分别感染AFP阳性(HepG2)或阴性(HeLa,BRL-3A)细胞株(m.o.i.=100),以丙氧鸟苷(ganciclovir,GCV)处理后,用MTT法测定杀伤细胞的效应。结果,AdCMVTK感染这三种细胞后,GCV半杀伤浓度分别为1.3、2、<1μmol/L;但是,AdrAFPTK感染的HeLa和BRL-3A细胞的GCV半杀伤浓度都>1000μmol/L,而对HepG2细胞只有<1μmol/L,表现出极高的细胞专一性。重组腺病毒AdrAFPTK可望用于肝癌的专一性基因治疗 相似文献
17.
利用HSV—TK基因治疗肝癌的离体研究 总被引:2,自引:1,他引:1
利用DNA重组技术,将HSV-TK基因克隆至逆转录病毒载体(XM-6/TK)。经PA317细胞包装后,转染人肝癌细胞HepG2。结果显示,XM-6/TK转染HepG2细胞与野生型相比,其生长特点和细胞形态未有改变。给予抗病毒药物-环氧鸟苷(Ganciclovir,GCV)后,转染细胞生长受到严重抑制,细胞数量明显降低。细胞学检查证实,GCV处理后,转染细胞的死亡率显著增加。本结果提示,应用HSV-TK基因治疗肝癌可能为一种治疗肿瘤新的方法 相似文献
18.
重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人单核细胞趋化激活因子(MCAF)融合蛋白经SephadexG-75和CM-SepharoseFF两步柱层析,获得了电泳纯的GM-CSF/MCAF融合蛋白。为进一步研究其结构与功能,我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。DotELISA和Westernblot试验表明,该抗血清效价高、特异性好,可分别与GM-CSF/MCAF、GM-CSF和MCAF发生反应。 相似文献
19.
重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和人单核细胞趋化激活因子(MCAF)融合蛋白经SephadexG-75和CM-SepharoseFF两步柱层析,获得了电泳纯的GM-CSF/MCAF融合蛋白。为进一步研究其结构与功能,我们以纯化的该融合蛋白为抗原免疫家兔制备抗血清。DotELISA和Westernblot试验表明,该抗血清效价高、特异性好,可分别与GM-CSF/MCAF、GM-CSF和MCAF发生反应。 相似文献
20.
低分子量硫酸葡聚糖对小鼠造血干细胞动员作用的研究 总被引:3,自引:0,他引:3
给小鼠静脉注射低分子量(<10 ̄4u)硫酸葡聚糖(DS)15mg/kg后外周血中白细胞、单个核细胞(mononuclearcek,MNC)、CFU-GM、BFU-E和CFU-Mix产率等指标出现时相性变化。给药后1h开始升高,2h达到高峰、分别为药前值的2.2、2.6、3.8、4.4和3.0倍,7h时趋向正常。给药后2h上述各类细胞在外周血中的含量随着DS的剂量增加而增加。白细胞、MNC计数在DS180mg/kg时达到峰值,均为对照组的4倍。240mg/k8时未见明显增加。不同剂量DS对各系祖细胞均有不同程度的动员作用,DS剂量15-30mg/kg效果最好,每升血中CFU-GM、BFU-E、CFU-Mix的数量分别相当于对照组的5.0、11.9和8.8倍。其峰值出现时间与白细胞、MNC不同,表明DS对不同类型细胞的作用机制也不尽一致。经口给小鼠投以DS240和48omg/kg后,未见外周血中白细胞、MNC计数有显著性升高,提示对造血干细胞没有动员作用。 相似文献