变铅青链霉菌66中对噬菌ΦHAU3显示抗性的基因（ψHAU3￣R）的核苷酸定序和分析

杂合质粒ｐＩＪ８３１０是链霉菌低拷贝质粒ｐＩＪ９２２１携带了１０．８ｋｂ来自变铅青链霉菌ＪＴ４６菌株,编码对噬菌体ΦＨＡＵ３抗性的ＤＮＡ片段。已知Ｔｎ４５６０插到该克隆中３ｋｂ的ＥｃｏＲＩ或３．３ｋｂ的ＢａｍＨＩ片段（这两个片段之间有２．５ｋｂ的重叠区）上,中断了ΦＨＡＵ３抗性基因的表达。已将３．０ｋｂ的ＢｃｏＡＩ片段分别以两种不同的取向克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（＋）上。核苷酸序列分析揭示出一个１．３ｋｂ的ＯＲＦ的存在,其所编码的４７８个氨基酸组成的蛋白与λ噬菌体的ｅａ５９基因所编码的氨基酸序列显示了高度的同源性,其氨基酸序列的同一性高达３７％,相似性达５８％,而λ噬菌体的ｅａ５９基因是编码赖ＡＴＰ和单键ＤＮＡ的核酸内切酶Ｉ的,该区域与λ的复制无关。此外,这段具有高度同源性的ＤＮＡ区域的Ｇ＋Ｃ％只有６０％,低于变铅青霉菌ＤＮＡＧ＋Ｃ％的平均值（７４％）。     

变铅青链霉菌对噬菌体ψHAU3抗性与异常修饰之间的相互关系

变铅青链霉菌异常修饰突发菌株ＺＸ１同时丧失了对噬菌体ψＨＡＵ３的抗性。遗传学杂交结果揭示,ＤＮＡ降解和对ψＨＡＵ３抗性这两种表型从不发生分离。以ＺＸ１为宿主和链霉菌低拷贝质粒ＳＣＰ２衍生的载体ｐＩＪ９２２为载体,构建了变铅青链霉菌ＪＴ４６的基因组文库。在８０００多个转化子中获得了一个能使ＺＸ１对ψＨＡＵ３显示抗性的杂合质粒,命名为ｐＩＪ８３１０。它除了含有完整的ｐＩＪ９２２外,还携带了大约１１ｋｂ     

噬菌体ψHAU3的cos位点及其与寄主相互作用的功能位点attP和attB的…

ψＨＡＵ３是寄主范围很广的放线菌噬菌体。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交实验表明,ψＨＡＵ３可以整合到吸水链霉菌应城变种１０－２２和变铅青链霉菌６６的突变体ＺＸ１的染色体中,形成溶原,其溶原菌自发释放ψＨＡＵ３,不受热激和紫外线照射的诱导。通过比较ψＨＡＵ３衍生噬粒ＰＩＪ８３００的ＤＮＡ酶切片段的中热前、后电泳带谱的区别,将ψＨＡＵ３的ｃｏｓ位点在ＰＩＪ８３００的图谱上得到了定位。还利用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的     

变铅青链霉菌与放线菌噬菌体φHAU3相互关系的研究

变铅青链霉菌ＺＸ１,是由变铅青链霉菌ＪＴ４６经ＮＴＧ诱变后产生的一株修饰基因突变株,与其亲本ＪＴ４６相比,ＺＸ１除了与ＤＮＡ降解有关的基因发生了突变（Ｄｎｄ－,即该突变株的ＤＮＡ在含有Ｆｅ２＋的缓冲液中电泳不受到降解,而野生型变铅青链霉菌在同样条件下则遭到降解）以外,对噬菌体　ＨＡＵ３的抗性也随之消失,这项特征主要表现在噬菌斑大小和成斑单位（效价）上的显著变化。研究结果表明,噬菌体　ＨＡＵ３以同等的频率吸附野生型变铅青链霉菌及其突变菌株ＺＸ１,从　ＨＡＵ３基因组中没有克隆到被变铅青链霉菌识别的特异性靶位点;噬菌体ＨＡＵ３的ＤＮＡ也可以转染野生型变铅青链霉菌原生质,但其释放的噬菌体粒子只能感染突变菌株ＺＸ１,而不能感染野生型变铅青链霉菌。噬菌体ＨＡＵ３在突变株ＺＸ１中的繁殖遵循一步生长曲线,单菌释放量大约为１００,而　ＨＡＵ３感染野生型变铅青链霉菌后,则检测不到噬菌体的释放。     

变铅青链霉菌对噬菌体φHAU3抗性与异常修饰之间的相互关系

变铅青链霉菌异常修饰突变菌株ＺＸｌ同时丧失了对噬菌体ＨＡＵ３的抗性,遗传学杂交结果揭示,ＤＮＡ降解和对ＨＡＵ３抗性这两种表型从不发生分离。以ＺＸｌ为宿主和链霉菌低拷贝质粒ＳＣＰ２衍生的载体ｐＩＪ９２２为载体,构建了变铅青链霉菌ＪＴ４６的基因组文库。在８０００多个转化子中获得了一个能使ＺＸ１对ＨＡＵ３显示抗性的杂合质粒,命名为ｐＩＪ８３１０。它除了含有完整的ｐＩＪ９２２外,还携带了大约１１ｋｂ的外源片段。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实,这个外源片段来源于ＪＴ４６,但在ＺＸ１中完全消失。利用转座子Ｔｎ４５６０对该克隆进行诱变定位,获得了中断噬菌体抗性基因表达的衍生质粒,并已证实Ｔｎ４５６０插入在一个２．５ｋｂ的ＢｄｍＨＩ一ＥｃｏＲＩ片段上。     

噬菌体φHAU3的cos位点及其与寄主相互作用的功能位点attP和attB的定位

ＨＡＵ３是寄主范围很广的放线菌噬菌体。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交实验表明,ＨＡＵ３可以整合到吸水链霉菌应城变种１０－２２和变铅青链霉菌６６的突变体ＺＸ１的染色体中,形成溶原,其溶原菌自发释放ＨＡＵ３,不受热激和紫外线照射的诱导。通过比较ＨＡＵ３衍生噬粒ｐＩＪ８３００的ＤＮＡ酶切片段在加热前、后电泳带谱的区别,将ＨＡＵ３的ｃｏｓ位点在ｐＩＪ８３００的图谱上得到了定位。还利用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交的方法定位了ＨＡＵ３与宿主形成溶原时附着位点（ａｔｔＰ）,并利用脉冲电泳技术定位了在变铅青链霉菌ＺＸ７和吸水链霉菌应城变种１０－２２中形成溶原的附着位点（ａｔｔＢ）。这些信息均有利于以ＨＡＵ３为基础的载体的发展和优化。     

A Facile Synthesis of the Phosphoramidites of 2-N-Methyl-2′-deoxy (or 2′-O-allyl)-ψ-isocytidine, 1, 3-Dimethyl-2′-deoxy-ψ-uridine and N1-Methyl-2′-O-allyl-ψ-uridine as Synthons Suitable for Oligonucleotide Synthesis

Abstract

An efficient and facile syntheses of 5′-O-(4, 4′-dimethoxytrityl)-3′-[2-cyanoethyl bis(1-methylethyl)]phosphoramidites of 2-N-methyl-2′-deoxy-ψ-isocytidine (6), 2-N-methyl-2′-deoxy-α-ψ-isocytidine (13), 2-N-methyl-2′-O-allyl-ψ-isocytidine (11), 1, 3-dimethyl-2′-deoxy-ψ-uridine (4) and N1-methyl-2′-O-allyl-ψ-uridine (19) have been accomplished in good overall yields. The pyrimidine-pyrimidine transformation reaction was found to be useful for the preparation of 2-N-methyl-2′-O-allyl-ψ-isocytidine (10). The utility of these novel phosphoramidites is demonstrated by their incorporation into oligonucleotides via solid-support, oligonucleotide methodology.     

小麦萌发素G和ψG的纯化及其部分特性

利用亲和层析方法纯化了小麦草酸氧化酶G和ψG,并对其生化特性进行了初步分析.G和ψG的最适pH为3.5,在60℃以下较稳定.当草酸浓度大于0.2mmol/L时,G和ψG的活性受到抑制.G和ψG的Km值分别为0.084和0.053mmol/L.0.1 mmol/L的EDTA、NH4 、Cl-、Mn2 、Mg2 、Na 和K 对G和ψG的活性没有影响,0.1 mmol/L的Zn2 、Cu2 、Fez 、Al3 、CO32-、NO3-和SO42-抑制G和ψG的活性.0.1 mmol/L的H2PO4-和HPO42-仅抑制G的活性.0.1 mmol/L的核黄素、FMN和FAD抑制ψG活性,G的活性则不受FAD和FMN的影响.     

恒态光合磷酸化与△pH和△ψ的关系

在恒态下推动ATP形成的△μH~+中,除ApH外,△ψ的贡献也很明显:进行PSP反应,耗用H~+,降低了⊿pH幅度。NH_4Cl,尼日利亚菌素(Nig)对⊿pH和PSP的抑制作用是同步的。CCCP影响膜对质子的透性,加速内部质子外流,降低内部质子浓度,减少⊿pH幅度,抑制了PSP反应。PSP更依赖于类囊体内部质子浓度。在短杆菌环肽(Gram)(～5×10~(-8)mol/L)和缬氨霉素(Val)(～5×10~(-7)mol/L,+K~+)的作用下,⊿ψ几乎被完全消去,并对⊿pH无明显作用,但PSP分别被抑制了～30％(Gram)和～50％(Val),表明在恒态PSP反应中有30％～50％的能量来源可由⊿ψ提供。     

多核苷酸合成的研究 Ⅴ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端半分子反密码区GpCpm~1Ipψ的合成

本文报道用化学方法合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3’-端半分子反密码区中的GpCpm~1IpΨ四核苷三磷酸片段。合成路线是由_(Ho)Ψ~(Bz)(OBz)_2开始,采用逐个伸长的方式,依次同保护单核苷酸_(MMT)m~1I(OBz)-p,_(MMT)C~(Bz)(OBz)-p和_(iBu)G~(iBu)(OiBu)-p缩合得到全酰化的保护四核苷三磷酸,最后用NH_3/甲醇溶液脱去全部酰基保护基并经柱层析分离纯化得GpCpm~1IpΨ。所用缩合剂均为DCC。纯化后的GpCpm~1IpΨ层析电泳鉴定均一,碱解和酶解得到预期的核苷酸组成比例。     

A Practical Synthesis of N1-Methyl-2′-deoxy-ψ-uridine (ψ-Thymidine) and Its Incorporation into G-Rich Triple Helix Forming Oligonucleotides

Abstract

A convenient synthesis of N1-methyl-2′-deoxy-ψ-uridine (ψ-thymidine, ψT, 7a) has been accomplished in good yield. The structural conformation of 7a was derived by 2D NMR and 1D NOE experiments. The nucleoside 7a has been incorporated into G-rich triplex forming oligonucleotides (TFOs) by solid-support, phosphoramidite method. The triplex forming capabilities of the modified TFOs (S4, S5 and S6) containing ψT has been evaluated in antiparallel motif with a target duplex (duplex-31) 5′d(CTGAGACCGGGAAGGAGGAAGGGCCAGTGAC)3′-5′d(GACTCTGGCCCTTCCTCCTTCCCGGTCACTG)3′(D1) at pH 7.6. The triplex formation of modified homopyrimidine-oligomers (S1, S2 and S3) has also been studied in parallel motif with a duplex-10 (A₁₀:T₁₀) at pH 7.0.     

一种用SigmaPlot求PV曲线水分参数ψtlp的方法

以扶桑(Hibiscus Rose-sinensis)为例,用SigmaPlot for Windows软件分别绘制PV曲线双曲线和直线部分的散点图,同时拟合双曲线和直线方程.然后通过联立方程组求出质壁分离点的坐标值,计算出质壁分离时的渗透势(ψtlp)、相对水含量(RWCtlp)和相对渗透水含量(ROWCtlp).并与常用的直线回归法的结果进行了比较.该方法具有简单、准确、快速等特点,是获得PV曲线主要参数的一种新方法.     

高效位点特异性链霉菌ψC31噬菌体整合酶的研究进展

链霉菌ψC31噬菌体整合酶(ψC31-int)属于位点特异性重组酶的解离酶/转化酶系,该家族催化机制由丝氨酸介导,能识别噬菌体附着位点(attP)和宿主基因组上的细菌附着位点(attB),介导同源序列之间的位点特异性重组.实验证实,ψC31-int是一种高效位点特异性整合工具酶,与其他整合策略相比,具有集高效和安全于一体的优点,通过介导位点特异性整合,将外源基因特异地整合到宿主基因组,使目的基因得以持续、高效的表达,并且具有DNA容量方面的优势.随着研究的深入,人们对ψC31-int介导整合作用机制和影响因素有了进一步的认识.通过一系列成功应用ψC31-int进行的基因治疗的动物学实验,为今后如何利用非病毒载体系统进行基因治疗及转基因动物模型的建立提供了一种新的选择.     

多核苷酸合成的研究——Ⅴ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端半分子反密码区GpCpm~1pψ的合成

本文报道用化学方法合成酵母丙氨酸转移核糖核酸3′-端半分子反密码区中的GpCp-m~1IpΨ*四核苷三磷酸片段。合成路线是由_(HO)Ψ~(Bz)(OBz)_2开始,采用逐个伸长的方式,依次同保护单核苷酸_(MMT)m_1I(OBz)-p,_(MMT)C~(Bz)(OBz)-p和_(1Bu)G_(iBu)(OiBu)-p缩合得到全酰化的保护四核苷三磷酸,最后用NH_3/甲醇溶液脱去全部酰基保护基并经柱层析分离纯化得GpCpm~1IpΨ。所用缩合剂均为DCC。纯化后的GpCpm_1IpΨ层析电泳鉴定均一,碱解和酶解得到预期的核苷酸组成比例。     

多核苷酸合成的研究——ⅩⅢ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子中Cpm~1IpψpG的酶促合成

本文报道了酵母丙氯酸转移核糖核酸3’端半分子反密码区的四核苷酸片段Cpm~1IpΨFpG的合成。先以Cpm~1pΨ为引物,GDP 为底物,在PNPase 和RNase T_1两个酶的协同作用下,生成Cpm~1lpΨpGp,对应用这两个酶进行合成的规律作了摸索与归纳,使合成Cpm~1IpΨpGp的产率达到90%以上,它再经固定化碱性磷酸单酯酶脱磷得到Cpm~1IpΨpG,脱磷率达到98%,此工作通过合成方法旁证了RNase T_1不水解m~1Ip-N 键。     

多核苷酸合成的研究——ⅩⅢ.酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子中Cpm~1IpψpG的酶促合成

本文报道了酵母丙氨酸转移核糖核酸3′端半分子反密码区的四核苷酸片段Cpm~1IpψpG的合成。先以Cpm~1Ipψ为引物,GDP为底物,在PNPase和RNase T_1两个酶的协同作用下,生成Cpm~1IpψpGp,对应用这两个酶进行合成的规律作了摸索与归纳,使合成Cpm~1IpψpGp的产率达到90%以上,它再经固定化碱性磷酸单酯酶脱磷得到Cpm~1IpψpG,脱磷率达到98%,此工作通过合成方法旁证了RNase T_1不水解m~Ip-N键。     

基于LMI方法的多时滞中立型随机神经网络的ψ~γ稳定性

研究了一类具有多个时滞的中立型随机神经网络的均方φ~γ稳定性问题,应用Lyapunov-Krasovskii泛函稳定性理论和线性矩阵不等式(LMI)方法,建立了系统解的均方φ~γ稳定性判别准则.     

地中海拟无枝菌酸菌专一的噬菌体ψMMR1的研究

从生产力复霉素ＳＶ的地中海拟无枝菌酸菌Ｕ１１９的工业发酵罐裂解液中,分离到一株新的噬菌体ψＭＭＲ。该噬菌体经多次单斑分离、纯化,得到的噬斑多数为清亮的（约占９０％）,其它噬斑为浑浊斑,但未能从中分离到溶源菌。在被测试的可能的宿主菌中,ψＭＭＲ１不能感染除地中海拟无枝菌酸菌以外的菌株,说明寄生范围很窄。对ψＭＭＲ１的增殖和储存条件,诸如ｐＨ值、温度、二价金属离子、有机溶剂等对ψＭＭＲ１的影响进行了较