生物膜膜蛋白三维结构研究的现状与展望

1　生物膜膜蛋白三维结构研究的重要性与迫切性　　细胞是生命的基本结构与功能单位 .细胞的外周膜与细胞内的膜系统称为生物膜 .细胞的能量转换、信息识别与传递、物质运送和分配等基本生命现象都与生物膜密切相关 .生物膜是由蛋白质、脂类以及碳水化合物等组成的超分子体系 ,膜蛋白是膜功能的主要体现者 .生物膜膜蛋白可分为外周膜蛋白和内在膜蛋白 ,后者约占整个膜蛋白的 70 %～ 80 % ,它们部分或全部嵌入膜内 ,有的则是跨膜分布 ,如受体、离子通道、离子泵、膜孔、运载体(ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ)以及各种膜酶等等 .象水溶性蛋白质一样 …     

膜蛋白结晶方法学研究进展

膜蛋白执行着物质运输、能量转换和信号转导等重要生物学功能,其分子的三维结构解析对阐述其功能及开展理性药物设计有着十分重要的意义．目前膜蛋白结构解析以X射线单晶衍射技术为主,该技术需要高质量晶体作为衍射对象．然而由于膜蛋白具有两亲性,难以得到高度有序的三维晶体,进而导致其结构解析十分困难．针对此问题,研究者们发展了一些专门面向膜蛋白的结晶方法,如基于去垢剂的方法,基于脂类的方法等．本文回顾了这些方法,并对未来膜蛋白的结晶研究进行了展望．     

膜蛋白晶体的生长及其进展

生物膜中与脂双层结合的蛋白质称为膜蛋白.由于它们具有很大的疏水表面以及既亲水又疏水的两性特点致使其纯化与结晶都十分困难.在膜蛋白晶体生长系统中引入小分子去污剂与小的两性分子获得突破性进展.迄今为止,结晶出来的膜蛋白为数不多.其中只有光合细菌绿色红假单胞菌及球型红假单胞菌的反应中心得到3分辨率的晶体结构与解析.一系列膜蛋白形成二维晶体,可用电子显微镜与像重构技术获得三维结构信息.     

膜蛋白的拓扑学

膜蛋白的拓扑学是研究膜蛋白三维结构的出发点．利用融合蛋白和化学修饰等实验技术已确定了很多膜蛋白的拓扑学．对膜蛋白的转运与插膜的研究确定可能存在两类插膜元件．对已知拓扑学的膜蛋白的统计分析以及蛋白质工程的研究表明存在膜蛋白拓扑学的内正规则．目前已形成预测膜蛋白的拓扑学的比较可靠的策略,这在反向生物学上具有重要意义.但要进行三维结构的预测还有许多路要走．     

核磁共振波谱法在蛋白质三维结构解析中的应用

蛋白质特定的三维结构与其生物功能密切相关,因此,研究蛋白质的三维结构有助于揭示其生物功能机制。将核磁共振（NMR）波谱法应用于研究溶液状态下蛋白质的三维结构,能够更加准确地揭示蛋白质结构与生物功能之间的关系。本文综述了NMR解析蛋白质三维结构的理论和技术方法,以及NMR结合其他生物物理手段,并辅以分子建模计算法研究蛋白质三维结构的研究进展和最新方法,为精准解析蛋白质的三维结构提供思路及策略。     

蛋白质结构研究

生物大分子的功能主要取决于它们的三维结构、运动及相互作用。对蛋白质结构的解析可以从根本上阐明蛋白质功能的分子机制和基础,同时也是研究蛋白质功能的一个重途径。本文简述了当前蛋白质结构研究的主要手段,如X射线晶体学、核磁共振波谱学和三维电镜重构方法学等及其优缺点和适用性,总结了目前蛋白质结构研究进展并对将来的发展方向进行了一些探讨。尽管上述三种主要的研究方法已经比较成熟,而且在适用对象和实验方法上有很好的相互补充,但还是有相当多的生物学问题在结构水平上得不到解释和支持。因此,本文对目前蛋白质结构研究的热点和难点——膜蛋白和蛋白质复合物的研究现状和方法做了简要的概述,希望能够引起广大同行的关注。     

融合标签技术在膜蛋白结构研究中的应用

膜蛋白高级结构的研究包括不同的层次,即膜蛋白拓扑学结构的研究、利用核磁共振技术和蛋白质晶体衍射技术对三维结构的研究,以及膜蛋白复合体的研究。在研究过程中,如果能够基于膜蛋白的拓扑学结构预测,选择合适的蛋白质或多肽融合标签,利用基因融合技术在基因水平上对膜蛋白进行改造,可以产生含有融合标签的重组膜蛋自,不仅具有原有膜蛋白的功能活性,还具有融合标签所特有的生理生化特性,将会极大地促进膜蛋白结构和功能的研究。我们就目前膜蛋白结构研究中所涉及的融合标签技术及其应用策略和所取得的进展做一简述。     

一种利用荧光蛋白mNeonGreen2鉴定EI24蛋白拓扑结构的方法

方便且精准地检测跨膜蛋白拓扑结构,尤其是跨膜片段的氨基(N-)和羧基(C-)端的朝向,有利于发现新的蛋白质与蛋白质之间的相互作用,并进一步揭示蛋白质重要的生物学功能．自组装荧光蛋白已被广泛用于观察蛋白质与蛋白质之间的相互作用、标记细胞内源蛋白质并实现mRNA定位的可视化．本文扩展了自组装荧光蛋白的应用,将自组装荧光蛋白mNeonGreen2与定点标记技术相结合,以确定跨膜蛋白的拓扑结构．通过该方法,第一次清楚地证明了EI24的N端和C端均朝向细胞质方向．此外,该方法可用于确定定位于其他细胞器且结构尚未解析的跨膜蛋白的拓扑结构．     

一种利用荧光蛋白mNeonGreen2鉴定EI24蛋白拓扑结构的方法（英文）

方便且精准地检测跨膜蛋白拓扑结构,尤其是跨膜片段的氨基(N-)和羧基(C-)端的朝向,有利于发现新的蛋白质与蛋白质之间的相互作用,并进一步揭示蛋白质重要的生物学功能.自组装荧光蛋白已被广泛用于观察蛋白质与蛋白质之间的相互作用、标记细胞内源蛋白质并实现mRNA定位的可视化.本文扩展了自组装荧光蛋白的应用,将自组装荧光蛋白mNeonGreen2与定点标记技术相结合,以确定跨膜蛋白的拓扑结构.通过该方法,第一次清楚地证明了EI24的N端和C端均朝向细胞质方向.此外,该方法可用于确定定位于其他细胞器且结构尚未解析的跨膜蛋白的拓扑结构.     

膜蛋白结构解析中的重要进展

概述了膜蛋白结构研究的重要性。介绍了应用X射线晶体学技术解析大肠杆菌乳糖通透酶LacY三维结构取得的重要进展——发现磷脂含量在膜蛋白结晶中所起的关键性作用。为未来膜蛋白结构的解析提供了新的思路。     

基于内含肽的自剪切技术在膜蛋白研究中的应用

膜蛋白对于细胞的物质运输、信号传递以及能量转化有重要意义,其研究通常需要大量结构稳定和有活性的膜蛋白。基于内含肽的蛋白质自剪切特性,可以设计自剪切标签以及构建具有特定结构的膜蛋白,为膜蛋白的结构和功能研究提供的新的研究思路和方法。本文对基于内含肽的蛋白质自剪切技术在膜蛋白结构和功能研究中的最新进展进行了简介。     

生物三维电子显微学进入全新高速发展时期

生物三维电子显微学主要由三个部分组成——电子晶体学、单颗粒技术和电子断层成像术,其结构解析对象的尺度范围介于x射线晶体学与光学显微镜之间,适合从蛋白质分子结构到细胞和组织结构的解析。以冷冻电镜技术与三维重构技术为基础的低温电子显微学代表了生物电子显微学的前沿。低温单颗粒技术对于高度对称的病毒颗粒的解析最近已达到3．8A分辨率,正在成为解析分子量很大的蛋白质复合体高分辨结构的有效技术手段。低温电子断层成像技术目前对于真核细胞样品的结构解析已达到约40A的分辨率,在今后5年有望达到20A。这样,把x射线晶体学、NMR以及电镜三维重构获得的蛋白质分子及复合体的高分辨率的结构,锚定到较低分辨率的电子断层成像图像中,从而在细胞水平上获得高精确的蛋白质空间定位和原子分辨率的蛋白质相互作用的结构信息。这将成为把分子水平的结构研究与细胞水平的生命活动衔接起来的可行途径。     

基于小波分析的膜蛋白跨膜区段序列分析和预测

膜蛋白是一类结构独特的蛋白质,在各种细胞中普遍存在,发挥着重要的生理功能。目前仅有少数膜蛋白听结构被实验测出,因此用计算机预测膜蛋白的结构是蛋白质结构预测的主要研究内容之一。膜蛋白一般在膜上形成保守的跨膜螺旋结构,序列特征明显,比较适合用预测的方法确定跨膜螺旋区段的位置。国际上已有一些研究者用人工神经网络方法、多序列比对方法和统计方法进行了预测尝试,取得了一定的成功经验。我们对蛋白质序列数据库中的     

蛋白质晶体培养方法的新进展

本文总结了最近以来国外在蛋白质晶体培养方面应用薄层凝胶等电聚焦电泳消除蛋白质样品的微观不均一性,改善晶体质量;在培养蛋白质晶体的溶液中加入适量的洗涤剂,β-辛基葡萄糖苷改善和改变水溶性蛋白质晶体生长的特性;采用聚乙二醇/洗涤剂,或者硫酸铵/洗涤剂体系培养膜蛋白晶体等新方法。     

脂立方相技术体系在膜蛋白结构与功能研究中的应用进展

脂立方相是包含连续脂双层和水通道的材料。其作为跨膜蛋白质结晶的有效介质,是一些重要和高难度膜蛋白结构解析的关键。因此,脂立方相技术体系越来越受到结构生物学家的重视。该文就脂立方相的特性及其结晶相关技术的最新进展作一简要阐述,并介绍该技术体系在膜蛋白生化分析与体外复性研究中的应用现状。     

植物跨膜蛋白研究进展

跨膜蛋白是一类结构独特,在植物细胞中广泛存在,并发挥重要生理功能的蛋白质。综述了植物跨膜蛋白的理化性质、蛋白质结构预测的方法,以及其生理功能的研究进展。随着对植物跨膜蛋白的深入研究,将有助于揭示跨膜蛋白对植物生长发育调控的重要分子机制。     

预测蛋白质可结晶性研究进展

解析蛋白质的三维结构具有重要的生物学意义,更是蛋白质功能研究和理性药物设计的基础。目前解析蛋白质结构最重要的方法是X-射线衍射晶体学解析技术。但是运用该技术解析蛋白质结构的关键是获得高质量的蛋白质晶体。然而,据统计仅有42%的可溶纯化蛋白质能够得到晶体,即不同蛋白质的可结晶性表现不同。由于实验方法验证蛋白质的可结晶性耗时耗力,因此,有研究者运用计算机模拟的方法预测蛋白质的可结晶性,从而节省资源与成本并且提高实验的成功率。本文结合我们的研究工作,介绍了几种目前较为成功的蛋白质可结晶性预测方法及其研究途径。     

基于序列拓扑和二阶隐马尔可夫模型的跨膜蛋白亚细胞定位预测

现有蛋白质亚细胞定位方法针对水溶性蛋白质而设计,对跨膜蛋白并不适用。而专门的跨膜拓扑预测器,又不是为亚细胞定位而设计的。文章改进了跨膜拓扑预测器TMPHMMLoc的模型结构,设计了一个新的二阶隐马尔可夫模型;采用推广到二阶模型的Baum-Welch算法估计模型参数,并把将各个亚细胞位置建立的模型整合为一个预测器。数据集上测试结果表明,此方法性能显著优于针对可溶性蛋白设计的支持向量机方法和模糊k最邻近方法,也优于TMPHMMLoc中提出的隐马尔可夫模型方法,是一个有效的跨膜蛋白亚细胞定位预测方法。     

制备用于结晶的蛋白质样品

制备高质量蛋白质晶体是通过X射线衍射解析蛋白质分子三维结构的关键环节,是结构生物学领域中的瓶颈问题之一。蛋白质的结晶受多因素控制,其中蛋白质样品自身的质量是影响蛋白质能否结晶及晶体质量好坏的关键因素。我们从蛋白质纯度、可溶性、均一性及表面修饰等方面介绍了如何获得适于结晶的蛋白质样品,以及如何借助相关仪器检测蛋白质样品的质量,预测蛋白质的可结晶性。     

结核分枝杆菌膜蛋白的异源表达与纯化研究进展

膜蛋白是一类与生物膜相互作用、具有重要功能和独特结构的蛋白质。异源表达纯化一直是了解膜蛋白结构和功能的重要瓶颈。结核分枝杆菌作为典型的胞内致病菌,其膜蛋白的研究具有很好的代表性以及重要意义。目前用于表达膜蛋白的有大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等表达系统,但结核菌膜蛋白的表达宿主还往往局限于大肠杆菌。异源表达需要综合考虑蛋白的来源、疏水性、跨膜区等特性。低温、加入共表达因子以及改变培养条件有助于结核菌膜蛋白的可溶性表达。另外,包涵体复性也是获得结核菌目的膜蛋白的重要途径。随着新的表达系统,新的促可溶表达策略,新的包涵体复性手段,新的纯化方法的应用,将有更多的膜蛋白异源表达纯化成功,为蛋白质功能研究奠定基础。