用8质粒病毒拯救系统产生H9N2/WSN重组A型流行性感冒病毒

把禽流行性感冒(流感)病毒A／Chicken／Shanghai／F／98(H9N2)的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)基因cDNA克隆至polⅠ-pol Ⅱ双向转录和表达载体pHW2000,用这两种质粒与8质粒病毒拯救系统中流感病毒A／WSN／33(H1N1)6个内部基因cDNA的质粒组合(6 2重排),共转染COS-1细胞,产生了能在鸡胚中高滴度增殖的H9N2／、WSN重组病毒。用A／WSN／33的8个基因cDNA质粒作对照,也产生了转染子病毒。经过EID50测定和MDCK感染实验,新基因型H9N2／WSN病毒感染鸡胚的能力强(EID50为10^-11／0．2m1),而且对鸡胚的毒力弱,在不加胰酶的情况下不使MDCK细胞产牛病变。经电镜观察,两个转染子病毒的形态与野生型流感病毒相似。反向遗传操作技术的建立,为对禽流感病毒基因功能和疫苗构建等方面的研究提供了新的手段。     

H3N2亚型猪流感病毒的拯救及HA与NA基因的替换

摘要：【目的】为研究流感病毒突破种间屏障分子机制,筛选流感基因工程疫苗株。【方法】本实验以猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本株,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接, 重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,拯救出全部基因均来自于亲本株的猪流感病毒rgH3N2,并分别以人流感病毒A/ PR/8/34(H1N1)、禽流感病毒A/Duck/Nanchang /4-165/2000 (H4N6 )、马流感病毒A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)的HA和NA基因替换A/Swine/Henan/S4/01的相应基因,【结果】生物学实验结果表明rgH3N2在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。rgH3N2经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1:256,接种MDCK细胞60 h后,血凝价可以达到1:64。基因替换后成功拯救出的重组病毒rgH1N1、rgH4N6和rgH3N8在鸡胚和细胞上均具有较高的增殖能力。【结论】病毒的成功拯救为流感病毒突破种间屏障分子机制,HA、NA基因在流感病毒跨种属传播中所扮演角色的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。     

一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析

从广东省疑似流感发病猪分离到1株H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Guangdong/01/2005(H3N2)),对其各个基因进行克隆与测序,并与GenBank中收录的其它猪流感、禽流感和人流感的相关基因进行比较,结果表明,HA全基因与广东2003~2004年分离的H3N2猪流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上,与纽约90年代末分离的H3N2人流感毒株同源性在98.5%以上;NA基因与纽约1998~2000年分离的H3N2人流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上;NS基因、M基因的核苷酸序列与H1N1亚型猪流感毒株A/swine/HongKong/273/1994(H1N1)的核苷酸序列同源性较高,分别为97.9%、98.4%,与美洲A/swine/Iowa/17672/1988(H1N1)的核苷酸序列同源性分别为96.7%、97.1%;其他基因的核苷酸序列与H3N2人流感毒株具有很高的同源性。因此,推测其M和NS基因来源于H1N1亚型猪流感病毒,HA、NA及其他基因均来源于H3N2亚型人流感病毒。表明此H3N2亚型猪流感病毒为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型猪流感病毒经基因重排而得到的重组病毒。     

ELISA法检测H3N2亚型流感病毒Vero细胞适应株

目的:流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005va(H3N2)是一株以Vero细胞为培养基质能高产的病毒株,可用于制备以Vero细胞为基质的流感病毒裂解灭活疫苗;通过在低温下连续传代培养,可选育出流感病毒Vero细胞冷适应株,用于制备Vero细胞流感病毒减毒活疫苗为了便于对Vero细胞冷适应株的进一步研究,建立一个检测该病毒株的ELISA方法.方法:以流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)的纯化抗原为免疫原制备羊抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)和鸡抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2)的抗血清.将抗血清先后经硫酸铵沉淀法和Protein G亲和层析柱纯化后,以纯化的羊抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2) IgG为包被抗体,鸡抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2) IgG为第二抗体,测定包被抗体、第二抗体和酶标抗体最佳工作浓度,建立双抗体夹心ELISA检测方法.结果:羊抗A/Yunnan/1/2005Va (H3N2) IgG的最佳工作浓度为5μg/mL,鸡抗A/Yunnan/1/2005Va(H3N2) IgG的最适浓度为10 μg/mL,酶标抗体最佳稀释倍数为1∶4000.对已知的阳性样品,经双抗体夹心ELISA法测定的病毒滴度比血凝方法测定病毒滴度灵敏度高.结论:通过测定包被抗体、第二抗体和酶标抗体最佳工作浓度,建立了双抗体夹心ELISA检测流感病毒Vero细胞适应株病毒含量的方法.该方法操作简单、方便快速、敏感性高,可应用于Vero细胞冷适应株选育时对流感病毒Vero细胞适应株A/Yunnan/1/2005va(H3N2)的检测,对于研制Vero细胞流感减毒活疫苗有重要意义.     

表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白的重组腺病毒在猪体内的免疫试验

摘要:【目的】本研究旨在评价表达H3N2亚型猪流感病毒血凝素蛋白的重组腺病毒在猪体内的免疫效果。【方法】以10-8 TCID50、2×10-8 TCID50和4×10-8 TCID50的剂量经肌肉注射接种后2到6周每周检测血凝抑制（HI）抗体;比较肌肉注射、滴鼻、灌胃三种接种途径对仔猪免疫效果的影响,并通过攻毒保护试验进一步考察重组腺病毒rAd-HA-GFP在猪体内的免疫效力。【结果】以不同的剂量分别经肌肉注射免疫后, HI抗体水平与接种剂量呈正相关。三种接种途径均能刺激仔猪产生特异性抗体,肌肉注射组的HI抗体要高于其他两组,差异显著（P<0.01）。通过滴鼻和肌注注射方式进行攻毒后,阴性对照组仔猪在攻毒2d后出现体温升高、打喷嚏、咳嗽、流鼻液、精神沉郁、体重减轻等症状;而各免疫组仔猪未观察到明显的临床症状,各免疫组的病毒分离率也明显低于阴性对照组。【结论】重组腺病毒rAd-HA-GFP诱导的HI抗体达到1:320可以有效抵抗H3N2亚型猪流感病毒的侵袭,可以作为候选疫苗株。     

一例混合感染中H3N2和H7N9流感病毒的分子遗传特性

【目的】揭示一例混合感染中H3N2和N7N9流感病毒的分子遗传特性。【方法】通过荧光定量PCR法对标本进行流感病毒分型检测。通过二代测序技术对病毒分离物进行全基因组测序分析。【结果】2013年4月在南京市检测到一例人季节性H3N2流感病毒和禽流感H7N9病毒混合感染,混合病毒分别命名为A/Nanjing/M1/2013 (H3N2) (M1-H3N2)和A/Nanjing/M2/2013 (H7N9) (M2-H7N9)。分离株M2-H7N9 HA蛋白的Q226L位点和PB2蛋白E627K位点发生突变,增强了病毒对人体的感染能力。【结论】报道了一起人混合感染H3N2和N7N9流感病毒病例,提示人可能成为流感病毒基因“混合器”,应高度关注H7N9病毒与人季节性流感病毒的基因重配现象。     

2013～2014年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析

为分析2013~2014流感监测年度中国大陆地区H3N2亚型流感病毒的抗原性和基因变异情况,本文选择了本监测年度中国分离的H3N2亚型流感病毒,利用标准雪貂抗血清进行抗原性分析,利用Sanger测序法进行病毒基因测序,采用邻位相临法(Neighbor-Joining,N-J)方法进行种系进化分析,分析我国H3N2亚型流感病毒的变异情况,进一步比较其与疫苗株的匹配性。抗原分析显示,本监测年度H3N2亚型流感病毒大部分为疫苗株A/Victoria/361/2011细胞株的类似株(99.6%),但以A/Texas/50/2012鸡胚株为参考抗原,只有15.1%为类似株,仅有11.9%与中国流行株的鸡胚分离株A/Shanghai-Changning/1507/2012抗原性类似。HA基因特性分析显示我国毒株均位于同一大分支,NA基因没有发现与耐药性相关的氨基酸位点突变。总之,2013~2014流感监测年度我国H3N2亚型流感病毒在流行过程中未发生明显变异,但病毒在鸡胚中传代会导致关键氨基酸位点变异。应及时分析并发现我国病毒的抗原性和基因特性变异情况,推选出更适合我国的疫苗株。     

辽宁省2016‒2017年H3N2亚型流感病毒HA1基因特征分析

目的 了解2016‒2017年辽宁省H3N2亚型流感病毒基因变异情况及流行株与疫苗株的匹配情况。方法 采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）对分离得到的H3N2亚型流感毒株的HA1基因进行扩增,扩增片段经测序与近年来WHO推荐的北半球疫苗株进行比对和基因特征分析。结果 进化分析表明,2016‒2017年H3N2亚型流感病毒与近三年的疫苗株均不在同一分支上;基因特性分析中,所有病毒均在A、B抗原决定簇上发生了两处以上的变异;19株病毒的受体结合位点131位氨基酸发生了新的变异;20株病毒中有1株突变产生了新的半胱氨酸,提示可能有新的二硫键产生;糖基化位点并未检测到新的突变。结论 2016‒2017年辽宁省H3N2亚型流感病毒的抗原性及基因特性均发生了一定的变化,但变异程度不大,应密切关注疫苗株对流感病毒的免疫效果及流感毒株的变异情况。     

利用8质粒系统拯救A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2）株禽流感病毒

应用反向遗传技术将含有1998年中国大陆分离株H9N2亚型禽流感病毒(Avianinfluenzavirus,AIV)的8个基因片段的质粒共转染COS_1细胞,产生了与野生病毒生物学特性相同的H9N2亚型AIV。将A Chicken Shanghai F 98(CK SH F 98)株H9N2亚型AIV的8个基因组cDNA分别克隆到polⅠ_polⅡ转录 表达载体pHW2 0 0 0中,构建成8个转录表达载体重组质粒。将这8个质粒共转染COS_1细胞,2 4h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,4 8h后收取鸡胚尿囊液继续进行鸡胚传代,产生能致死鸡胚的病毒。经血凝、血凝抑制试验、序列分析和电镜观察,证实产生了CK SH F 98(H9N2 )株AIV。     

Generation of High-yield Vaccine Strain Wholly Derived from Avian Influenza Viruses by Reverse Genetics

Highly pathogenic avian influenza A (HPAI) viruses of the H5N1 subtypes caused enormous economical loss to poultry farms in China and Southeastern Asian countries. The vaccination program is a reliable strategy in controlling the prevalence of these disastrous diseases. The six internal genes of the high-yield influenza virus A/Goose/Dalian/3/01 (H9N2), the haemagglutinin (HA) gene of A/Goose/HLJ/QFY/04 (H5N1) strain, and the neuraminidase gene from A/Duck/Germany/1215/73 (H2N3) reference strain were amplified by RT-PCR technique. The HA gene was modified by the deletion of four basic amino acids of the connecting peptide between HA1 and HA2. Eight gene expressing plasmids were constructed, and the recombinant virus rH5N3 were generated by cell transfection. The infection of chicken embryos and the challenge tests involving chickens demonstrated that the recombinant H5N3 (rH5N3) influenza virus is avirulent. The allantoic fluids of rH5N3-infected eggs contain high-titer influenza viruses with haemagglutination unit of 1:2 048, which are eight times those of the parental H5N1 virus. The rH5N3 oil-emulsified vaccine could induce haemagglutination inhibition (HI) antibodies in chickens in 2 weeks post-vaccination, and the maximum geometric mean HI-titers were observed 4–5 weeks post-vaccination and were kept under observation for 18 weeks. The rH5N3-vaccinated chickens were fully protected against morbidity and mortality of the lethal challenge of the H5N1 HPAI viruses, A/Goose/Guangdong/1/96 and A/Goose/HLJ/QFY/04, which had 8 years expansion and differences among multiple amino acids in HA protein. The N3 neuraminidase protein marker makes it possible to distinguish between H5N1-infected and H5N3-vaccinated animals.     

共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病忡H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE／L调控其转求,定向插入鸡痘病毒转移载体p11s中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE／L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGene^TM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt—FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用10^5PFU的rFPV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100％(8／8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100％,显示出一定的应用前景。     

利用反向遗传学技术构建H5亚型禽流感高产疫苗株

采用RT-PCR技术分别扩增了鹅源高产禽流感病毒的6条内部基因片段,近期分离的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因以及N3亚型参考毒株的神经氨酸酶基因,分别构建了8个基因的转录与表达载体,利用反向遗传学技术拯救出了全部基因都源于禽源的重组流感病毒疫苗株rH5N3。通过对血凝素蛋白HA1和HA2连接肽处的5个碱性氨基酸(R-R-R-K-K)基因缺失与修饰,从而消除了病毒基因的毒力相关序列,拯救的rH5N3疫苗株对鸡和鸡胚均无致病性,病毒在鸡胚尿囊液和细胞培养上清的HA效价得到极大提高,分别为12048和1512。制备的禽流感疫苗免疫动物后4~5周即可诱导产生高效价的HI抗体,鸡免疫后18周依然保持高水平的HI抗体。重组疫苗不论是对于国内早期分离的禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96还是近期分离的A/Goose/HLJ/QFY/04都能够产生完全的免疫保护作用,免疫鸡攻毒后不发病、不排毒、不死亡。带有N3鉴别诊断标记禽流感疫苗株的研制为H5N1高致病性禽流感的防治提供了新的技术保障。     

H9N2禽流感病毒反向遗传系统转录／表达载体的构建和验证

设计带有BsmBI、BsaI或AarI酶切位点的引物,用RT-PCR扩增H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的8个基因全长片段,克隆入双向转录/表达载体pHW2000,并在PB2、PB1和NA基因中共引入了3个沉默突变标签。将其2个表面基因(HA和NA基因)加上任意1个内部基因,而其它5个内部基因来自A/WSN/33,进行了6种3 5组合形式的基因重排,把相应组合的转录/表达质粒共转染COS-1细胞,均产生了预期组合、有感染性的H9N2亚型流感病毒,表明亲缘关系遥远的流感病毒可以互相获取基因片段产生重组病毒,提示表面结构基因和单个内部基因不足以限制H9N2AIV在哺乳动物细胞上的宿主范围,同时也验证了构建的8个转录/表达载体均能有效工作,为进一步研究H9N2亚型AIV基因结构与功能、AIV与宿主之间的关系打下了基础。     

H9N2禽流感病毒反向遗传系统转录/表达载体的构建和验证

设计带有BsmBI、BsaⅠ或AarⅠ酶切位点的引物,用RT PCR扩增H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的8个基因全长片段,克隆入双向转录/表达载体pHW2000,并在PB2、PB1和NA基因中共引入了3个沉默突变标签.将其2个表面基因(HA和NA基因)加上任意1个内部基因,而其它5个内部基因来自A/WSN/33,进行了6种3+5组合形式的基因重排,把相应组合的转录/表达质粒共转染COS-1细胞,均产生了预期组合、有感染性的H9N2亚型流感病毒,表明亲缘关系遥远的流感病毒可以互相获取基因片段产生重组病毒,提示表面结构基因和单个内部基因不足以限制H9N2 AIV在哺乳动物细胞上的宿主范围,同时也验证了构建的8个转录/表达载体均能有效工作,为进一步研究H9N2亚型AIV基因结构与功能、AIV与宿主之间的关系打下了基础.     

利用反向遗传技术产生8基因全禽源流感病毒疫苗候选株

利用反向遗传技术将含有A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)株禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的6个内部基因与H5N1亚型AIV的2个表面基因HA和NA共转染COS-1细胞,产生了6 2全禽源的重配AIV。将H5N1亚型AIV的HA基因经基因突变致弱,然后将A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)AIV的6个内部基因的cD-NA和以上致弱的禽源HA基因及NA基因的cDNA分别克隆到转录/表达载体pHW2000中,构建成8个转录/表达质粒。将8个质粒共转染COS-1细胞,24h后收获细胞及上清接种SPF鸡胚,72~90h后鸡胚死亡,收取鸡胚尿囊液进行血凝、血凝抑制试验、序列分析、病毒致病性试验和动物免疫保护试验,最终证实产生了致弱的全禽源AIV疫苗候选株。     

H3N2型猪流感病毒M2蛋白表达分析

流感病毒的M2蛋白在流感病毒复制中起着重要作用,是抗流感病毒的靶标分子。本研究以提取的病毒基因组RNA作为模板,RT-PCR扩增H3N2亚型猪流感病毒M2基因,分别构建了重组原核表达载体和重组真核表达载体,建立了M2蛋白的原核和真核表达系统。通过大肠杆菌表达系统,制备了M2重组蛋白,并免疫大鼠制备了多克隆抗体。Western blotting和间接免疫荧光方法检测表明所制备的抗体能识别真核表达的M2蛋白和病毒感染细胞后表达M2蛋白,具有良好的特异性。重组M2真核表达载体转染Vero细胞,表达的重组M2蛋白大小为20kDa,定位于细胞浆中,与病毒感染细胞中的M2蛋白定位相同。Western blotting检测表明M2蛋白在病毒感染细胞12h后才能检出,晚于NS1、NP和M1,属于病毒复制的晚期蛋白,可作为病毒复制晚期的指示分子。本研究为弄清M2蛋白在病毒复制过程中的生物学功能奠定了基础。