bZIP转录因子CfHac1参与调控果生刺盘孢菌的生长发育和致病力

油茶炭疽病是油茶Camellia oleifera上最重要病害之一,引起该病害的主要致病菌为果生刺盘孢菌Colletotrichum fructicola。本研究以果生刺盘孢菌bZIP类转录因子CfHac1为研究对象,研究其在果生刺盘孢菌的营养生长、产孢量、附着胞形成、致病力及耐受性等方面的生物学功能,为油茶炭疽病的防控提供理论依据。研究结果表明,果生刺盘孢菌中具有一个与灰色大角间座壳（稻瘟菌）bZIP转录因子MoHac1直系同源的基因,命名为CfHAC1。该基因全长1 627bp,编码526个氨基酸,该蛋白含有一个碱性亮氨酸链（bZIP）结构域和3个未知功能结构域。CfHAC1基因敲除突变体的菌丝生长速度显著变慢,分生孢子产量显著减少且不能正常形成附着胞,并对山梨糖醇和KCl渗透压胁迫敏感性增加;致病力测试结果表明,果生刺盘孢菌基因敲除突变体ΔCfhac1对油茶的致病力显著下降。转录因子CfHac1参与调控果生刺盘孢菌的生长、产孢、附着胞的形成、致病力以及响应外界渗透压胁迫过程。     

稻巨座壳小麦致病型检测防控研究进展

稻巨座壳小麦致病型是麦瘟病的致病菌,是一种新近出现并对全球小麦生产造成巨大威胁的危险性真菌.本文总结归纳了稻巨座壳小麦致病型分类学、地理分布和寄主范围等多方面信息,并探讨了该病菌检测和防控等方面的研究进展.迄今为止,该病害防控较为困难,化学杀菌剂并不能提供有效的防治效果,加强检疫并实施严格检疫措施是防控该病害发生扩散的...     

组蛋白去乙酰化酶CfSnt2调控果生刺盘孢生长发育和致病力

炭疽病是油茶Camellia oleifera的重要病害,该病害的优势致病菌是刺盘孢属Colletotrichum的果生刺盘孢C. fructicola,在全国的油茶产区普遍发生。我们前期发现组蛋白乙酰转移酶CfGcn5调控油茶果生刺盘孢的生长发育和致病过程,但组蛋白去乙酰化酶在该病菌中的生物学功能尚不清楚。本研究以组蛋白去乙酰化酶CfSnt2为研究对象,利用反向遗传学的方法,通过对野生型、CfSNT2基因敲除突变体及互补菌株的生物学表型进行比较分析,发现CfSNT2基因敲除突变体的菌丝生长速率明显减缓、分生孢子的产量显著减少、附着胞形成率降低、对细胞壁胁迫剂的响应异常,同时对油茶致病力显著减弱。以上现象说明CfSnt2调控果生刺盘孢的生长、产孢、附着胞的形成、对细胞壁完整性胁迫剂的耐受性及致病力。     

柑橘溃疡病菌II型分泌通道基因xpsD突变体的鉴定及功能分析

【目的】鉴定柑橘溃疡病菌胞外水解酶减弱突变体Mxac56-20的Tn5插入位点,及其在柑橘上的致病力。【方法】采用质粒拯救方法获得Tn5旁侧序列,与基因组信息比对后明确突变体的插入位点;构建功能互补载体对突变体进行功能互补,检测互补菌株胞外蛋白水解酶、纤维素酶和淀粉酶的恢复情况;在寄主植物柑橘上观察致病力变化。【结果】Mxac56-20的Tn5插入位点是II型分泌系统xpsD基因,所构建的互补载体使突变体的胞外水解酶活性和致病力得到恢复。【结论】柑橘溃疡病菌xpsD基因的突变,导致胞外水解酶活性降低,在寄主上的致病力减弱,说明柑橘溃疡病菌的II型分泌系统在与寄主互作过程中起到致病因子的作用。     

带有报告基因的板栗疫病菌寄生隐赤壳分泌表达突变体库的构建及分泌缺陷突变体的筛选

丝状真菌分泌蛋白与其致病性密切相关,目前对于病原真菌的蛋白胞外分泌途径及其调控机制的报道不多。为建立一个方便高效的真菌分泌蛋白调控途径的遗传研究体系,本研究以植物病原丝状真菌——板栗疫病菌寄生隐赤壳Cryphonectria parasitica为对象,选取分泌表达量最高的两个分泌蛋白的信号肽SP1和SP2,分别构建带有GUS报告基因的分泌蛋白表达载体pCPXBle-SP1-GUS和pCPXBle-SP2-GUS并用于转化板栗疫病菌。选择高效分泌GUS蛋白的转化株SP1-9为出发菌株,利用农杆菌介导的遗传转化技术构建了T-DNA插入突变体库,从576个突变体中筛选到2株GUS分泌表达明显降低的突变体。本研究成功构建了可用于研究丝状真菌蛋白分泌的遗传研究体系,并筛选获得了分泌蛋白缺陷突变体,为深入研究丝状真菌分泌途径及其调控机制奠定了基础。     

稻瘟菌MgORP1基因敲除突变株的构建及其表型分析

[目的]了解稻瘟病菌中氧固醇结合蛋白(oxysterol-binding proteins related proteins,缩写为ORPs)家族成员组成情况,构建MgORP1基因缺失突变株和互补株,对MgORP1基因功能进行初步研究.[方法]以ORPs家族的典型结构域"ORD"为靶标,对稻瘟病菌基因组数据库进行BlastP搜索.通过同源重组的策略,构建MgORP1基因缺失突变体,再通过重新导入该基因全长片段获得互补株.然后对野生型、突变体和互补株进行菌落、分生孢子和附着胞形态或形成情况、以及致病力进行比较分析.[结果]稻瘟病菌基因组中含有6个可能的ORPs族蛋白,其中MgORP1基因的破坏降低了稻瘟菌在完全培养基上的菌落生长速率和产孢量.但对菌丝、分生孢子和附着胞的形态,以及在水稻上的致病力没有明显影响.[结论]MgORP1基因可能与稻瘟病菌的菌落生长和产孢量相关.     

细胞自噬及其调控病原真菌致病毒力的研究进展

自噬是细胞通过自我降解、重新利用胞内蛋白质和细胞器的过程,有利于帮助生物体抵御饥饿或其他不良环境条件。以酵母等为对象的研究揭示细胞自噬可分为3种类型:巨自噬、微自噬以及分子伴侣介导的自噬,均具有重要的生理功能,其中针对巨自噬的机理研究最为深入广泛。不同自噬相关基因分别组成不同的功能模块,各自调控或完成自噬起始、自噬体形成、泛素化修饰和底物降解等。自噬活性的启动及不同底物的降解受表观遗传、转录、转录后及翻译后等多重调控。针对不同自噬相关基因功能的研究结果表明,不同病原真菌中存在与酵母自噬同源基因既保守又高度分化的生物学功能或效应。与酵母同源基因的生物学效应不同,不同关键自噬基因可分别参与调控病原真菌产孢、菌丝生长、细胞分化、侵染结构成熟,以及致病毒力等。自噬与致病毒力的关联性拓展了病原真菌致病机理的研究范畴,进一步研究病原菌自噬与寄主免疫互作的效应机制具有重要的生物学意义。     

稻瘟病菌机械敏感性离子通道的鉴定及功能分析

稻瘟病是水稻上危害最为严重的病害之一,其病原菌为子囊菌门稻瘟病菌。作为模式真菌,研究稻瘟病菌的致病机理不仅能为其病害防治提供理论依据,也给其它病原真菌提供借鉴意义。离子通道是细胞内外物质交换的窗口,具有成为防治靶标的潜力,对病害防控具有重要意义。机械敏感性离子通道是一类通过感受细胞膜张力变化来实现胞内外机械信号转导的离子通道。运用生物信息学鉴定了稻瘟病菌的3条机械敏感性离子通道蛋白Mo Msc1,Mo Mid1和Mo Yvc1,进化分析表明它们在真菌里具有保守性。还对稻瘟病菌的小电导率机械敏感性离子通道蛋白Mo Msc1进行了功能分析,该基因沉默并未影响其生长发育、外界胁迫、细胞壁完整性及致病力。     

条形柄锈菌吸器特异效应蛋白Hasp68抑制寄主免疫并与小麦组织蛋白酶B互作

作为活体营养专性寄生真菌,条形柄锈菌（小麦条锈病）在侵染过程中通过形成吸器向寄主细胞释放效应蛋白,干扰寄主的防卫反应,促进其侵染与致病。因此,条形柄锈菌效应蛋白的鉴定与功能研究对揭示其毒性机理具有重要意义。本实验室前期完成了条形柄锈菌CYR31生理小种吸器转录组分析,从中鉴定得到一个吸器特异诱导表达分泌蛋白Hasp68,利用农杆菌侵染在烟草细胞中瞬时表达该基因,能够抑制小鼠促细胞凋亡蛋白Bax诱导的细胞程序性死亡,鉴定为条形柄锈菌候选效应蛋白。Hasp68基因全长318bp,编码105_aa,N-端包含20_aa的信号肽,无保守结构域。BlastX分析表明Hasp68为条形柄锈菌特有效应蛋白,在其他真菌中无同源蛋白,且在条形柄锈菌16个菌系中呈较低的序列多态性,表明其在条形柄锈菌的进化过程中相对保守。借助荧光假单胞菌EtHAn的三型分泌系统,在小麦细胞中过表达Hasp68能够抑制由非致病细菌引起的PTI（PAMP-triggered immunity）相关胼胝质的积累;同时,也能抑制小麦与无毒条形柄锈菌互作中ETI（effector-triggered immunity）相关的活性氧爆发和过敏性坏死反应,表明效应蛋白Hasp68具有抑制寄主免疫反应的功能。利用酵母双杂交系统筛选Hasp68在小麦中的互作蛋白,发现其与组织蛋白酶B（cathepsin B）TaCTSB互作,双分子荧光技术进一步验证二者在烟草细胞中共表达存在互作,初步揭示了效应蛋白Hasp68的互作靶标。     

基因CfATG6和CfATG14参与调控果生刺盘孢细胞自噬和致病力

【目的】炭疽病是油茶的主要病害,由刺盘孢属的多种真菌引起,其中果生刺盘孢分布范围最广、分离率最高,是油茶炭疽病的主要致病菌。研究自噬相关蛋白CfAtg6和CfAtg14的生物学功能,为进一步揭示果生刺盘孢通过细胞自噬调控致病的分子机制,并为油茶炭疽病的防治提供理论基础。【方法】根据同源重组原理,通过聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)介导的方法,在果生刺盘孢中敲除基因CfATG6和CfATG14,并进一步获得回补菌株ΔCfatg6-C和ΔCfatg14-C。【结果】酵母双杂交试验结果显示,果生刺盘孢蛋白CfAtg6和CfAtg14可能存在互作关系。生物学表型测定结果表明,相较于野生型和回补菌株,突变体ΔCfatg6和ΔCfatg14均表现出营养生长速率显著减慢,附着胞形成率分别只有野生型的5%和18%;突变体ΔCfatg6和ΔCfatg14致病力均极显著减弱,造成的油茶叶片病斑面积少于野生型和回补菌株的1/3;CfATG6和CfATG14基因缺失突变体均丧失转运和降解CfAtg8蛋白的能力,并对细胞壁胁迫更敏感。突变体ΔCfatg6的分生孢子产量显著降低,仅为野生型的20%左右;氧化胁迫试验结果表明,相较于野生型和回补菌株,过氧化氢对突变体的生长抑制率升高10%左右。内质网压力胁迫试验表明,ΔCfatg14对二硫苏糖醇抑制率升高5%以上。【结论】自噬相关基因CfATG6和CfATG14参与调控了果生刺盘孢生长发育、细胞自噬和致病力。     

CfNop12参与调控果生刺盘孢生长发育、低温胁迫响应和致病力

果生刺盘孢是油茶炭疽病的主要致病菌。研究果生刺盘孢RNA结合蛋白基因CfNOP12的生物学功能,阐述果生刺盘孢致病的分子机制,为油茶炭疽病的防治提供理论基础。根据同源重组原理,在果生刺盘孢中敲除目标基因CfNOP12,PCR验证获得正确的突变体ΔCfnop12;进一步构建PYF11::CfNOP12回补质粒,导入突变体原生质体中,筛选成功互补菌株ΔCfnop12-C。对这些菌株进行生物学表型测定,发现突变体ΔCfnop12营养生长速率显著下降,分生孢子的产量及附着胞形成率显著降低;在含有细胞壁胁迫剂的PDA培养基上,突变体ΔCfnop12的抑制率相较于野生型和回补菌株显著升高,在低温条件下,突变体的生长速率表现出明显下降;野生型和回补菌株几丁质聚集在菌丝顶端,突变体ΔCfnop12尖端几丁质分布不正常;相比于野生型和回补菌株,突变体致病力显著降低。综上所述,潜在RNA结合蛋白基因CfNOP12参与调控了果生刺盘孢生长发育、低温胁迫响应和致病力。     

灰葡萄孢丝裂原活化蛋白激酶编码基因bmp1和bmp3的功能

【背景】植物病原真菌丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号途径参与病菌有性生殖、细胞壁完整、菌丝侵染、致病力、胁迫响应等过程,灰葡萄孢MAPK信号途径参与病菌生长发育、致病力以及胁迫响应,但MAPK信号途径基因在灰葡萄孢中的功能尚未完全阐明,该信号途径对灰葡萄孢的生长发育和致病力的调控机制尚不明确。【目的】明确灰葡萄孢MAPK编码基因bmp1、bmp3在病菌生长发育、致病力以及氧化胁迫响应过程的功能,为进一步阐明MAPK信号途径调控灰葡萄孢生长发育和致病力的分子机制奠定基础。【方法】利用RNAi技术构建灰葡萄孢MAPK编码基因bmp1和bmp3的RNAi突变体,并以野生型BC22菌株为对照,对bmp1和bmp3基因的RNAi突变体的表型、致病力以及对氧化胁迫的敏感性进行分析。【结果】灰葡萄孢bmp1和bmp3基因的RNAi突变体其菌落形态、菌丝形态均与野生型BC22菌株没有明显差别;bmp1基因的RNAi突变体生长速率明显减慢,分生孢子产量明显降低;bmp3基因的RNAi突变体的生长速率与野生型BC22菌株没有明显差别,不能产生分生孢子。bmp1和bmp3基因的RNAi突变体在番茄果实的表面均不能产生明显的致病症状,而且不能穿透玻璃纸。bmp1基因的RNAi突变体在含有H_2O_2的培养基上受抑制的程度显著低于野生型,而在含甲萘醌的培养基上受抑制的程度显著高于野生型;bmp3基因的RNAi突变体在含有H_2O_2和甲萘醌的培养基受抑制的程度均显著高于野生型。【结论】灰葡萄孢bmp1基因正调控病菌生长、分生孢子形成、致病力和穿透能力,参与调控病菌对氧化胁迫的响应;灰葡萄孢bmp3基因正调控病菌分生孢子形成、致病力、穿透能力以及对氧化胁迫的响应。     

植物类LORELEI糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白研究进展

类LORELEI糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(LLG)定位于细胞质膜外表面, 作为CrRLK1L家族类受体激酶的分子伴侣, 参与其转运和胞外信号转导, 从而调控植物生殖发育以及免疫与逆境应答等过程。LLG2/3与ANX和BUPS互作, 调控花粉管顶端生长与爆裂。LLG1与FER (FERONIA)互作, 调控下游的NADPH氧化酶产生活性氧(ROS), 促进根部细胞伸长和根毛生长。此外, LLG1作为FER的共受体, 与快速碱化因子(RALFs)互作, 调节G蛋白β亚基(AGB1)和质膜H ⁺-ATPase功能、胞内ROS稳态以及Ca ²⁺瞬变, 引起根部和气孔的盐应答反应。LLG1与FLS2和EFR互作激活下游RbohD, 调节ROS产生, 调控植物免疫应答。该文综述了植物LLG的相关研究进展, 可为深入理解LLG的生物学功能提供重要信息。     

蛋白-O-岩藻糖基转移酶1基因CfPOFUT1在果生炭疽菌中的功能分析

【目的】蛋白-O-岩藻糖基转移酶1 (protein O-fucosyltransferase 1,POFUT1)是催化蛋白质O-岩藻糖基化的关键酶,在动物和人体内被证明调控一系列的生理病理过程,然而POFUT1基因在果生炭疽菌乃至真菌中还未见报道。本研究旨在克隆果生炭疽菌中CfPOFUT1基因,并分析其生物学功能。【方法】利用RT-PCR技术扩增CfPOFUT1的基因并进行生物信息学分析,构建了CfPOFUT1基因的沉默和过表达载体,通过PEG介导法将载体导入原生质体中获得CfPOFUT1基因的沉默和过表达突变体。测定了野生型菌株、CfPOFUT1沉默菌株和过表达菌株在PDA上的菌丝生长、分生孢子产生、萌发与附着胞形成、胁迫应答和致病力、杀菌剂敏感性等生物学表型。【结果】与野生型菌株相比,基因过表达突变体产孢量显著增加,致病力增强,对嘧菌酯敏感性降低,但对多菌灵和咪鲜胺敏感性增强。基因沉默突变体产孢量减少,细胞壁完整性、内质网应激敏感性提高,致病力减弱,对嘧菌酯敏感性提高,但对多菌灵和咪鲜胺敏感性降低。【结论】CfPOFUT1基因参与调控果生炭疽菌分生孢子产量,细胞壁完整性、内质网对应激和药剂敏感性,并对其致病性也具有一定的影响。     

水稻黄单胞菌hrp基因簇中致病相关基因hpaB的鉴定

由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害。通过筛选18000个XooTn5转座子插入突变体,得到其中一个致病力缺失的突变体XOG11。TAIL-PCR方法分离该突变体中插入转座子的侧翼序列,发现转座子插入到位于hrp基因簇的hpaB基因中。对该基因进一步的分析表明该基因编码一个含有156个氨基酸,等电点为4.28,亮氨酸含量为14.4%的蛋白HpaB。Southern blot和PCR验证表明Tn5在该突变体中为单拷贝插入且未发生转座子携带侧翼序列的转移。将hpaB克隆到具有广泛寄主的质粒pHM1中,转化重组质粒进入突变体后,突变体恢复了在其寄主水稻IR24上的致病力,而转化空质粒pHM1后的突变体仍然表现为致病力缺失。证实了水稻黄单胞菌中hpaB基因与该细菌的致病力相关,在侵染水稻的过程中起着不可缺失的作用。     

苹果树腐烂病菌细胞色素P450基因Vmcyp5的功能

【目的】研究表明,细胞色素P450(CYP)在死体营养型真菌的毒素合成代谢中发挥重要作用,预测可能与病原菌致病相关。论文对苹果树腐烂病菌(Valsa mali)毒素合成基因簇中的1个上调表达的CYP基因Vmcyp5进行生物学功能研究,明确CYP基因对病原菌致病力影响,为细胞色素P450基因家族对苹果树腐烂病菌致病机理的进一步研究提供依据。【方法】通过Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术获得具有G418抗性的突变体,并对突变体进行PCR检测及Southern blotting验证得到单拷贝敲除突变体。将目的基因片段重新导入敲除突变体,筛选获得互补突变体。最终对野生型菌株及敲除突变体、互补突变体进行菌落、产孢及致病力观察,利用SPSS软件对数据进行差异显著性分析,并利用q RT-PCR技术分析突变体黑色素基因簇的表达水平。【结果】通过基因敲除技术获得1个Vmcyp5基因的敲除突变体。与野生型菌株相比,Vmcyp5基因的敲除突变体菌落呈白色,产孢量减少51.3%。q RT-PCR分析发现敲除突变体黑色素基因簇基因表达量降低。重要的是,敲除突变体致病力较野生型菌株降低24.5%。互补突变体菌落颜色、产孢及致病力近似恢复至野生型菌株水平。【结论】Vmcyp5基因与病原菌黑色素合成、子实体的产生和致病力相关。     

丝裂原活化蛋白激酶基因CfMKK1调控果生炭疽菌的生长发育和致病力

【目的】由果生炭疽菌引起的炭疽病是油茶的主要病害,造成油茶产量下降。本文研究果生炭疽菌中丝裂原活化蛋白激酶CfMkk1的生物学功能,旨在为解析油茶炭疽病菌的致病机理提供依据。【方法】根据同源重组原理构建CfMKK1基因敲除载体片段,采用PEG介导法将载体导入原生质体中筛选获得突变体菌株DCfmkk1;PCR扩增果生炭疽菌含有启动子的CfMKK1基因回补片段,构建回补载体pYF11::CfMKK1;采用PEG介导法把回补载体转化至突变体的原生质体中,荧光筛选回补菌株ΔCfmkk1-C。测定野生型菌株、突变体菌株DCfmkk1及基因回补菌株ΔCfmkk1-C在营养生长、附着胞形成、胁迫应答和致病力等生物学表型。【结果】与野生型和回补菌株相比,CfMKK1基因敲除突变体ΔCfmkk1菌丝生长速率明显减缓;在含刚果红的PDA培养基上菌丝生长受到明显抑制,无法穿透玻璃纸,丧失了侵染寄主的能力;而且无法形成附着胞。【结论】研究结果表明CfMKK1基因参与调控油茶果生炭疽菌的生长发育、附着胞形成、致病力以及响应外界胁迫过程。     

抗凋亡基因与消化系统恶性肿瘤的研究进展

细胞凋亡是机体在基因调控下主动清除多余细胞或缺陷细胞的正常生理现象,又称基因调控下细胞的程序性死亡。细胞凋亡异常在肿瘤发生发展过程中有重要的病理生理意义。自从凋亡理论提出以来,对肿瘤的发生发展有了新的认识。目前,肿瘤发病的观念已经从细胞生长过渡扩展到细胞凋亡障碍,已经发现了许多与细胞凋亡有关的蛋白和基因,其中抑制细胞凋亡的基因和蛋白与肿瘤的发生发展有着密切的关系,现就其与消化系统恶性肿瘤的关系研究新进展作一综述。1抗凋亡基因BAG-1与肿瘤1·1 BAG-1基因结构及其蛋白的功能BAG-1基因是Takayama等[1]于1995年…     

假定蛋白基因XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关

十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是研究植物病原细菌和寄主互作的模式细菌,鉴定其致病相关基因对于控制作物病害有重要的意义。XC2038在Xcc 8004中注释为功能未知的假定蛋白基因。本研究利用实验室前期构建的XC2038基因的Tn5gus A5插入突变体164H09,并构建了该突变体的互补菌株C164H09,随后对各菌株的致病性及相关表型进行了检测。结果表明,164H09影响Xcc 8004胞外多糖、泳动性及生物被膜的形成,影响在寄主满身红萝卜上的致病性,而突变体的互补菌株能将以上表型恢复至野生型水平。综上可知,假定蛋白基因XC2038与十字花科黑腐病菌致病相关。     

水稻黄单胞菌hrp基因簇中致病相关基因hpaB的鉴定水稻黄单胞菌 TAIL-PCR hrp基因簇 hpaB基因

由水稻黄单胞菌引起的水稻白叶枯病是水稻最严重的细菌性病害.通过筛选18000个Xoo Tn5转座子插入突变体,得到其中一个致病力缺失的突变体XOG11.TAIL-PCR方法分离该突变体中插入转座子的侧翼序列,发现转座子插入到位于hrp基因簇的hpaB基因中.对该基因进一步的分析表明该基因编码一个含有156个氨基酸,等电点为4.28,亮氨酸含量为14.4%的蛋白HpaB.Southern blot和PCR验证表明Tn5在该突变体中为单拷贝插入且未发生转座子携带侧翼序列的转移.将hpaB克隆到具有广泛寄主的质粒pHM1中,转化重组质粒进入突变体后,突变体恢复了在其寄主水稻IR24上的致病力,而转化空质粒pHM1后的突变体仍然表现为致病力缺失.证实了水稻黄单胞菌中hpaB基因与该细菌的致病力相关,在侵染水稻的过程中起着不可缺失的作用.