禾谷镰刀菌cAMP受体类GPCR生物信息学分析

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是引起小麦赤霉病的主要致病菌。G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors,GPCRs)是一类重要的细胞表面受体,其介导的cAMP信号通路可能参与了禾谷镰刀菌的致病和毒素合成,因此分析cAMP受体类型的GPCRs蛋白的结构及其理化性质对了解GPCRs的功能及其与赤霉病致病的关系具有重要意义。本研究运用生物信息学方法,对禾谷镰刀菌全基因组序列中cAMP类GPCR基因进行了生物信息学分析。发现禾谷镰刀菌中存在5个典型的cAMP受体类型GPCRs:FgcAR1、FgcAR2、FgcAR3、FgcAR4和FgcAR5,均含有7个跨膜结构域,并定位于细胞膜上。除FgcAR1外,其余为疏水性蛋白。蛋白质二级结构分析表明,均含有大量α螺旋,比例在60%左右,FgcAR4和FgcAR5没有β转角,FgcAR1、FgcAR2和FgcAR3也只有较少比例的β转角。这些GPCRs中含有较多的Ser和Thr磷酸化位点。遗传分析表明,禾谷镰刀菌cAMP受体类型的GPCR蛋白与假禾谷镰刀菌及F.langsethiae同源性最高,亲缘关系最近。本研究明确了禾谷镰刀菌中cAMP类GPCR蛋白的理化性质、定位、二级结构、磷酸化位点及进化关系,为了解小麦赤霉病发病机制及以GPCRs为靶标的新型杀菌剂研发奠定了基础。     

蛋白激酶FgBud32参与禾谷镰刀菌的生长发育、致病和胁迫应答

由禾谷镰刀菌引起的小麦赤霉病是一种毁灭性的小麦真菌病害,在世界范围内造成小麦产量和质量的巨大损失。实验室前期在禾谷镰刀菌中共鉴定到116个蛋白激酶,其中FgBUD32基因的缺失会造成营养生长和有性生殖方面的严重缺陷,但其在禾谷镰刀菌中的详细功能尚未报道。本研究通过系统比较Fgbud32突变体与野生型PH-1及互补菌株的表型差异,对FgBud32在禾谷镰刀菌中的生物学功能进行了解析。研究结果显示Fgbud32突变体在多个表型方面存在缺陷,与野生型菌株以及互补菌株相比,其生长速率急剧下降,菌丝弯曲且分支减少;分生孢子的产量显著降低,形态变短,隔膜减少,萌发率降低且萌发速率延迟;在有性生殖时期不能产生子囊壳或子囊壳前体;对小麦穗和胚芽鞘的致病力以及DON毒素的合成能力均显著下降。进一步胁迫试验表明,FgBUD32基因的缺失导致禾谷镰刀菌对氧化胁迫(H₂O₂)以及DNA损伤胁迫(羟基脲和甲磺甲酯)的敏感性增加。此外,我们还发现FgBud32在细胞核和细胞质中均有定位,且在一定时期或条件下会从细胞质向细胞核内聚集。综上所述,FgBUD32基因参与了禾谷镰刀菌的营养生长、极性生长、无性/有性生殖、DON毒素合成、致病以及对氧化胁迫和DNA损伤胁迫的应答等多种生命活动,但其具体的作用机制还有待深入研究。     

Brr2解旋U4/U6 SnRNAs的调控机制

前体mRNA(precursor messager RNA,pre-mRNA)剪接是去除内含子和将外显子彼此连接形成成熟mRNA的过程。剪接过程在一个呈动态变化的大核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)复合体,即剪接体催化作用下完成。DExD/H-box RNA解旋酶在剪接体组装、激活及解聚过程中都发挥着重要作用。Brr2(bad response to refrigeration 2)这种DExD/H-box RNA解旋酶是构成U5稳定的亚单位。Brr2含有两个串联解旋酶盒结构,在剪接体激活中负责U4/U6的解旋,还参与剪接体催化及解聚过程,因此Brr2在剪接过程中必需具备严格的调控机制。在剪接过程中,Prp8的C端包含两个连续的RNase H域和Jab1/MPN域,能够正负调控Brr2活性。Snu114在调节Brr2活性中具有非常重要的作用。此外,Brr2通过C端解旋酶盒(C-terminal cassette, CC)与N末端域(N-terminal region)进行分子内的自我活性调节。本文综述了近年来在Brr2的分子间和分子内活性调节机制的研究进展,这些不同的调节机制协同作用才确保真核生物pre-mRNA可变剪接的保真性。     

SR蛋白家族在RNA剪接中的调控作用

SR蛋白家族成员都具有一个富含丝氨酸/精氨酸(S/R)重复序列的RS结构域,在RNA剪接体的组装和选择性剪接的调控过程中具有重要的作用。绝大多数SR蛋白是生存的必需因子,通过其RS结构域和特有的其他结构域,实现与前体mRNA的特异性序列或其他剪接因子的相互作用,协同完成剪接位点的正确选择或促进剪接体的形成。深入研究SR蛋白家族在RNA选择性剪接中的调控机制,可以促进以疾病治疗或害虫防治为目的的应用研究。该文总结了SR蛋白家族在基础研究和应用方面的进展。     

TPA对Bcl-X前体mRNA在U251细胞中选择性剪接调控的初步研究

以含有部分Bcl-X序列的微小基因为研究模型,研究了TPA对Bcl-X前体mRNA选择性剪接在体内和体外的调控作用。通过RT-PCR和定点突变实验检测,结果表明PKC信号系统能调控Bcl-X前体mRNA选择性剪接,其机制可能是通过应答序列来调控Bcl-X前体mRNA5’上游和下游剪接位点的选择利用。     

草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因可变剪接体的克隆与表达分析

可变剪接是基因表达调控的一种重要方式。本研究利用RT-PCR克隆鉴定到草菇exo-β-1,3-葡聚糖酶基因(exg2)的4种可变剪接体(exg2V1,exg2V2,exg2V3和exg2V4),其中,exg2V1第7个内含子保留;exg2V2第11个内含子保留同时剪切掉第12个外显子的后58bp;exg2V3同时保留第7个和第17个内含子;exg2V4同时保留第2、第9和第17个内含子。4种剪接体均在可变剪接位点提前出现终止密码子,导致预测编码的氨基酸序列中包含不完整的结构域。定量PCR结果显示:草菇5个发育时期中,4种可变剪接体表达量均比标准剪接体exg2低,但4种可变剪接体的表达也表现出一定的时期和组织差异性。初步推断发现的草菇exg2基因4种可变剪接体均为无义介导的mRNA降解,通过此方式达到对exg2基因标准剪接转录本的精准调控。     

mRNA选择性剪接的分子机制

真核细胞mRNA前体经过剪接成为成熟的mRNA,而mRNA前体的选择性剪接极大地增加了蛋白质的多样性和基因表达的复杂程度,剪接位点的识别可以以跨越内含子的机制(内含子限定)或跨越外显子的机制(外显子限定)进行。选择性剪接有多种剪接形式：选择不同的剪接位点,选择不同的剪接末端,外显子的不同组合及内含子的剪接与否等。选择性剪接过程受到许多顺式元件和反式因子的调控,并与基本剪接过程紧密联系,剪接体中的一些剪接因子也参与了对选择性剪接的调控。选择性剪接也是1个伴随转录发生的过程,不同的启动子可调控产生不同的剪接产物。mRNA的选择性剪接机制多种多样,已发现RNA编辑和反式剪接也可参与选择性剪接过程。     

大鼠Mocs2基因跳跃型外显子可变剪接保留率的检测

可变剪接是真核生物基因表达调控的一种重要方式,它通过剪接位点调控ORFs (Open reading frames)区域外显子或内含子的表达,产生不同的mRNA剪接体,进一步翻译成具有相同或不同功能的蛋白质,从而对诸如发育、疾病、环境响应等生物学过程产生重要影响.已有文献报道,人类Mocs2基因exon 1a与exon 1b外显子发生互斥型可变剪接,产生的两个剪接体分别编码钼喋呤合酶的大小亚基,参与钼辅因子生物的合成过程.基于本课题组前期大鼠肺部组织RNA-seq测序的结果,发现Mocs2基因2号外显子转录后可被剪接或保留,产生两个不同的剪接体.为验证测序结果的准确性,本研究利用半定量PCR与实时荧光定量PCR两种方法检测大鼠脑、海马、肺组织中Mocs2基因2号外显子的保留率.半定量PCR方法检测大鼠肺、海马、大脑组织中Mocs2基因的保留率分别为(88.28±3.09)％、(99.44±0.24)％、(99.54±0.19)％.实时荧光定量PCR检测的保留率分别为(66.76±20.47)％、(75.60±12.44)％、(87.28±16.4)％.实验结果表明,Mocs2基因2号外显子在大鼠中存在可变剪接现象,且不同组织具有一定差异.本工作进一步验证了两种PCR方法检测前体mRNA可变剪接保留率的可行性.     

与剪接、翻译偶联的PRT—mRNA NMD降解机制

最新研究发现，真核细胞前体mRNA剪接不仅仅是前体mRNA的加工步骤，而且在翻译过程中也起到重要的监控作用，通过剪接，外显子－外显子连接点复合物结合于mRNA剪接位点上游20bp处，如果mRNA剪接位点上游大于50－55bp处出现无义突变，则这种翻译提前终止密码子mRNA将会在最后的翻译过程中通过外显子－外显子连接点复合物，Upf蛋白以及帽结合蛋白之间的相互作用，被引入脱帽，降解过程。     

一株链霉菌21-1的分离鉴定及其对禾谷镰刀菌的抑菌活性

【背景】由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病严重威胁我国的小麦生产。【目的】筛选对禾谷镰刀菌具有拮抗能力的链霉菌菌株,为生防菌剂开发提供理论基础。【方法】利用平板对峙法筛选对禾谷镰刀菌具有拮抗能力的链霉菌;通过形态特征、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定;通过病原菌菌丝生长、孢子产生及萌发抑制试验分析其发酵液的抑菌活性;利用人工接种试验测定该菌株发酵液的防病效果。【结果】筛选到一株对禾谷镰刀菌具有较强拮抗活性的链霉菌21-1,抑菌率为59.5%。依据形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析,将该菌株鉴定为黄三素链霉菌(Streptomycesflavotricini)。菌株21-1发酵液能够抑制禾谷镰刀菌的菌丝生长、孢子产生及萌发过程,而且可以降低禾谷镰刀菌菌丝中可溶性蛋白质的含量,并增加丙二醛的含量。菌株21-1可以产生蛋白酶及纤维素酶。菌株21-1菌液10倍稀释液对小麦赤霉病的防效最佳,为70.1%。此外,菌株21-1发酵液对其他8种植物病原菌均有较好的抑制作用。【结论】菌株21-1对禾谷镰刀菌有较好的抑菌活性,具...     

TTF-1相关蛋白26磷酸化位点突变体的构建

目的制备TTF-1相关蛋白26（TAP26）的3个磷酸化位点（S48,S66和T219）的突变体（TAP26（S48→A48）、TAP26（S66→A66）和TAP26（T219→V219））。方法采用定点诱变PCR技术,分别突变掉TAP26的3个磷酸化位点（S48,S66和T219）,并获得TAP26的3个相应突变体。结果DNA序列分析结果显示TAP26的3个突变体序列正确。结论通过定点诱变PCR技术,成功构建了TAP26的3个突变体。     

一株具霉菌抑制活性细菌的鉴定

为探讨菌株HB02对霉菌生长的影响,将HB02与霉菌孢子悬液同时加入到PYG肉汤,在28℃培养15d。在培养的第3、69、、12和15天测定培养液中的黄曲霉和禾谷镰刀菌菌丝重量。结果显示:与对照组相比,HB02可显著抑制黄曲霉和禾谷镰刀菌生长(P<0.01)。通过常规细菌学实验鉴定该菌株为一株乳酸杆菌。通过分子生物学方法测定了菌株的16S rRNA基因序列,进一步证实了HB02为一株乳酸杆菌。根据Berthier等的方法,通过HB0216S/23S rRNA基因间隔(Intergenic Spacer Regions,ISR)序列的扩增和测定,再通过基因文库中所有细菌基因序列比较分析,最终鉴定菌株HB02为一株弯曲乳酸杆菌(Lactobacillus curvatus)。     

禾谷镰刀菌中FgPDE1基因的敲除及其功能的研究

目的:旨在敲除禾谷镰刀菌Fusarium graminearum Fg PDE1基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。方法:应用Split-marker技术构建含有潮霉素基因敲除盒,通过PEG介导原生质体转化,PCR筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔFg PDE1,根据突变体表型变化及致病性的检测对Fg PDE1基因的功能进行分析。结果:采用Split-marker技术,成功构建了Fg PDE1基因敲除盒;PEG介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经PCR筛查,得到3个PCR确认的敲除突变体;表型观察发现,ΔFg PDE1菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明:以西红柿为侵染宿主,相对于野生型,突变体致病性没有明显减弱;但突变体分生孢子产量显著下降。结论:Fg PDE1基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。     

嗜热四膜虫异染色质蛋白Tcd1磷酸化位点的突变分析

四膜虫异染色质蛋白Tcd1在有性生殖时期特异表达,在大核基因组重排以及修复过程中发挥作用。磷酸化蛋白质组学分析表明,Tcd1存在3个磷酸化位点：S301,S303和S535。然而,Tcd1磷酸化修饰与其功能的关系并不清楚。本研究对TCD1基因的3个磷酸化位点进行了模拟磷酸化和模拟去磷酸化定点突变,获得模拟磷酸化突变基因TCD1S301D (TCD1S1D)、TCD1S301DS303D (TCD1S2D)与TCD1S301DS303DS535D (TCD1S3D) 和模拟去磷酸化的突变基因TCD1S301A (TCD1S1A)、TCD1S301AS303A (TCD1S2A)与TCD1S301AS303AS535A (TCD1S3A)。分别构建了不同突变体的过表达载体,转化四膜虫细胞并筛选获得不同突变体细胞株。Western印迹分析表明,Tcd1S1D、Tcd1S2D、Tcd1S3D与Tcd1S1A、Tcd1S2A和Tcd1S3A在四膜虫有性生殖期表达。免疫荧光定位分析发现,Tcd1S1D点状定位于细胞质中,Tcd1S2D在有性生殖初期点状定位于细胞质中,在新大核上形成均匀的定位,Tcd1S3D无法定位于亲本大核上,只是均匀定位于新大核上。Tcd1S2A和Tcd1S3A在新大核形成异常的块状定位,并且与异染色质蛋白Pdd1不能共定位。结果表明,Tcd1不同位点的磷酸化和去磷酸化修饰的动态变化决定了其在四膜虫细胞中的定位模式。     

一种新的Srrm1/SRm160可变剪接体经历无义突变介导的mRNA降解

目的:研究基因Srrm1/SRm160的可变剪接。方法:应用RT-PCR研究Srrm1/SRm160的可变剪接,通过蛋白质的翻译抑制和RNA干扰研究剪接异构体是否经历无义突变介导的mRNA降解(NMD)过程。结果:获得Srrm1/SRm160新的可变剪接异构体,该异构体产生提前终止密码子,翻译抑制和RNA干扰证实含有提前终止密码子的剪接体经过NMD而降解。结论:Srrm1/SRm160通过可变剪接和NMD调节自身的表达水平,作为剪接因子进一步调节其他基因的可变剪接。     

单增李斯特菌溶血素O的PEST序列激活ERK1/2磷酸化的作用

[目的]本研究旨在构建单核细胞增多性李斯特菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)溶血素O(Listeriolysin O,LLO)的关键结构域PEST序列(包含S44、S48和T51关键磷酸化位点)突变体,并针对其生物学功能展开研究。[方法]以李斯特菌参考菌株EGD-e为模板扩增编码LLO的hly基因,克隆至pET30a(+)原核表达载体,在此基础上利用氨基酸突变技术获得表达PEST突变体(LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A)的重组质粒,转入E.coli Rosetta感受态细胞中,诱导表达重组蛋白经镍离子亲和层析纯化后进行SDS-PAGE分析。利用红细胞裂解试验检测重组蛋白的溶血活性,并通过Western blotting检测重组突变蛋白刺激Caco-2细胞后对MAPK关键信号分子ERK1/2磷酸化水平变化的影响。[结果]结果显示,本研究成功获得重组LLO及其突变体蛋白LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A。在pH5.5和7.4条件下,LLO△PEST、LLOS44A、LLOS48A和LLOT51A均具有和LLO相当的溶血活性,说明PEST序列缺失或突变并不影响LLO的膜裂解活性。研究进一步发现,重组LLO及其突变蛋白刺激Caco-2细胞后均能激活ERK1/2的磷酸化。[结论]研究表明LLO的关键结构域PEST序列对于维持该蛋白的膜裂解能力及穿孔活性并非必需,且该结构域的缺失不影响李斯特菌在感染宿主时依赖LLO介导ERK1/2磷酸化的生物学过程。本研究将为进一步探索细菌感染过程中PEST序列对于LLO发挥生物学功能的潜在作用及分子机制奠定基础。     

PTC下游翻译的重新起始导致NMD途径的逃逸

无义突变介导的mRNA降解（nonsense mediated mRNA decay, NMD）途径是真核生物体内一种重要的mRNA监督质控机制, 它降解含有由无义突变、错误剪接、移码突变等产生的提前终止翻译密码子（premature translation termination codon, PTC）的mRNA, 从而防止这种mRNA翻译产生的截短型蛋白质对机体造成的伤害. 研究发现, 一些含有PTC的mRNA发生了NMD途径逃逸, 但具体机制仍不清楚.本研究将成视网膜细胞瘤基因1 (retinoblastoma gene 1, RB1)作为NMD途径的靶基因, 构建mini-RB1基因,包括外显子1～14(cDNA)、内含子14 外显子15 内含子15和外显子16～27(cDNA) 的三部分序列, 将其构建到真核表达载体pcDNA 3.1(-)中.根据人类基因组突变数据库选择3个突变位点W99X、G310X和R467X, 构建相应无义突变体.分别将mini RB1基因野生型和无义突变体转入HeLa细胞进行表达.用qRT-PCR检测发现, W99X无义突变体与野生型相比mRNA的水平无显著差异.为了进一步证实mini- RB1（W99X）发生了NMD逃逸, 利用NMD途径抑制剂放线菌酮和转录抑制剂放线菌素D, 分别处理转入野生型的mini RB1基因及其无义突变体mini-RB1（W99X）的哺乳动物细胞, 发现mini-RB1基因无义突变体的mRNA水平与野生型无明显差异, 说明含有W99X无义突变的mini-RB1基因的mRNA发生了NMD逃逸.Western印迹检测mini-RB1基因的蛋白质表达发现, 在无义突变位点W99X下游重新起始了蛋白质的翻译, 因此,PTC下游蛋白质翻译的重新起始可能是导致无义mRNA逃逸NMD途径监控的主要原因.     

剪接因子U2AF65相关蛋白的研究进展

U2核糖核蛋白小体辅助因子(U2AF)65是参与前体mRNA剪接的重要辅助因子,前体RNA生成之初,U1核糖核蛋白小体(snRNP)结合到内含子的5'剪接位点,U2AF65和U2AF35分别结合到多聚嘧啶序列和3'剪接位点,剪接因子1(SF1)结合到分支位点是剪接体形成的第一步。U2AF的存在又辅助U2snRNP代替SF1结合到分支位点,使剪接反应顺利进行。最近几年,发现基因组中存在一些U2AF65的旁系同源基因序列。这些旁系同源基因由祖先基因经连续复制而横向形成,复制出的基因副本经历了各自的进化途径,最终它们在结构和功能上有相似之处,又各有独特之处。我们简要讨论了U2AF65、PUF60、CAPERα和CAPERβ这4种同源蛋白的发现过程、结构特征、自身的多样性、基因的进化和生物学功能。     

以nit为遗传标记研究禾谷镰刀菌对氰烯菌酯的抗药性在菌丝融合过程中的遗传

分别从对氰烯菌酯敏感和抗性禾谷镰刀菌菌株中诱导了22个和50个nit突变体。通过比较它们的生物学特性表明,nit突变体在菌丝生长速率、培养形状以及致病性方面与其亲本没有显著差异,但是无性繁殖和有性繁殖能力有所改变。同时实验还表明,禾谷镰刀菌对氰烯菌酯和氯酸盐不存在交互抗性,且对氰烯菌酯和氯酸盐的双重抗性能够稳定地遗传。因此,可以将nit作为一个优良的遗传标记研究禾谷镰刀菌对氰烯菌酯的抗药性遗传。另外成功运用nit作为分子标记研究了禾谷镰刀菌对氰烯菌酯的抗药性在菌丝融合过程中的遗传和变异。研究结果表明,抗药性基因不能通过菌丝融合传递给另一个菌株或发生的概率极低,这将不利于对氰烯菌酯的抗性群体的发展。因此,菌丝融合在禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗药性群体发展中的作用较小。