尖孢镰刀菌古巴专化型MAPK FoSlt2敲除突变体的转录组分析

尖孢镰刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense（FOC）是威胁香蕉生产的重要土传病原真菌。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）FoSlt2信号通路在调控尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育、细胞壁完整性和致病性方面发挥着重要作用。为了揭示FoSlt2信号通路的致病机理和寻找农药靶标,本研究利用高通量RNA-seq技术对该病菌野生型菌株和FoSlt2敲除突变体菌株的转录组进行了比较分析,结果表明差异表达基因共有2 164个,其中上调表达基因有1 184个,下调表达基因有980个。Gene Ontology（GO）功能分析结果表明,差异表达基因主要参与在结合、催化分子功能组和代谢过程、细胞过程生物学通路中。KEGG 功能富集分析结果表明,差异基因主要参与戊糖和葡糖醛酸盐转换、氨基糖和核苷酸糖、氨基葡聚糖降解、磷酸肌醇和碳类物质代谢通路,说明这些通路与尖孢镰刀菌古巴专化型的生长发育和致病性相关。该研究为尖孢镰刀菌古巴专化型致病机制的阐明奠定了理论基础。     

尖孢镰刀菌四个专化型细胞核的初步研究

本文对尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的4个专化型12株菌的孢子萌发、核分裂时间及核DNA含量进行了比较,结果表明:不同专化型菌株孢子萌发速度基本一致,而萌发过程中发生第一次核分裂的时间不同。黄瓜、西瓜、荸荠、大豆各专化型第一次核分裂时间分别为:5.67hr、5.45hr、7.35hr、7.82hr,其核DNA含量分别为:0.321pg、o.306pg、0.177pg 0.174pg。测定结果显示出不同专化型菌株的孢子核DNA含量可能存在倍数关系,并推测F.oxysporum的黄瓜专化型与西瓜专化型为同一类型,而荸荠专化型与大豆专化型为同一类型。     

尖孢镰刀菌亚麻专化型Folprp4基因参与调控菌丝生长和分生孢子发生

目的: 通过对尖孢镰刀菌中Folprp4基因的鉴定,揭示其在尖孢镰刀菌中的功能及致病相关性。方法: 基于同源重组原理,根据测定出的Folprp4基因序列,应用Split-Marker重组技术构建含有潮霉素抗性基因(hph)的基因缺失盒。将基因缺失盒经PEG介导转化到野生型原生质体中,在含有潮霉素B的TCC培养基上筛选转化子,通过PCR正负筛查获得Folprp4基因缺失突变株(ΔFolprp4)。构建含有Folprp4基因的载体pZDH1,并将其转化到敲除突变体中进行互补测验。结果: 与野生型(hm)和异位插入突变体(ecFolprp4)相比,敲除突变体菌丝生长受到严重阻碍,当野生型和异位插入突变体长满整个平板时,敲除突变体菌落呈小点状。敲除突变体的另一个显著变化是ΔFolprp4的分生孢子产量显著下降。侵染实验表明,ΔFolprp4对亚麻幼苗的毒力显著降低。互补实验表明,该互补载体的回复子(Folprp4-C)在菌落形态、生长速率、分生孢子产量和毒力方面均恢复到了野生型菌株。结论: Folprp4基因与尖孢镰刀菌的菌丝生长、分生孢子发生和致病性有关。     

尖孢镰刀菌致病机理和化感作用研究进展

尖孢镰刀菌引起的枯萎病在生产中的防控相当困难。通过总结国内外相关文献,综述近年来有关尖孢镰刀菌致病机理和化感作用的研究进展。尖孢镰刀菌通过分泌毒素和细胞壁降解酶共同致病,谱系特异性区域的存在是其致病性强和宿主范围广的主要原因;在尖孢镰刀菌各专化型中已分离出大量致病相关基因;其他植物和拮抗微生物(木霉菌、丛枝菌根真菌、非致病性尖孢镰刀菌以及植物生长促生菌)可以分泌化感物质,作用于宿主植物和尖孢镰刀菌,直接抑制尖孢镰刀菌的生长或激活宿主植物的防御反应。未来有关尖孢镰刀菌致病机理研究应该在基因组测序基础上构建精细的遗传图谱;对化感作用的研究应当深入探讨分子机理,利用高通量测序等技术在转录组或蛋白组水平上明确宿主植物抗枯萎病相关基因,同时利用分子标记辅助育种来筛选新的抗枯萎病品种。     

基于多基因序列分析对尖孢镰孢菌古巴专化型（香蕉枯萎病菌）生理小种的鉴定

由尖孢镰孢菌古巴专化型Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc引起的香蕉枯萎病是香蕉生产上的毁灭性病害,自1996年以来已对我国华南地区香蕉生产造成了严重危害。传统上香蕉枯萎病菌生理小种的鉴定主要采用人工接种鉴别寄主尔后测定病菌致病性的方法,但实验周期长,且受季节影响。以来自澳大利亚的香蕉枯萎病菌生理小种1号（BW1）、2号（Race 2）、3号（Race 3）以及亚热带4号（BW4）为对照,对分离自我国华南地区主要香蕉产区（广东、广西、海南、福建等省区）的14株香蕉枯萎病菌的单孢菌株进行致病性测定,并结合热带4号小种（TR4）和亚热带4号小种（ST4）的分子特异检测方法,确定其生理小种类型;同时,利用ITS、TEF-1α、IGS、histone H3、β-tubulin等 5个主要用于镰孢菌系统发育学研究的基因,研究不同地区不同来源的Foc菌株之间的亲缘关系及其与非病原尖孢镰孢菌的关系,并评价这5个基因在香蕉枯萎病菌生理小种鉴定上的应用价值。研究结果表明：（1）来源于我国华南地区的4号小种主要为热带4号小种;（2）TEF-1α、IGS、histone H3等3个基因片段能够将Foc中不同生理小种的菌株划分成不同的系统发育谱系,与致病性测定的结果具有对应关系,也能较好地反映尖孢镰孢菌种内菌株的亲缘关系,可用于香蕉枯萎病菌生理小种鉴定;（3）我国Foc 1号生理小种的遗传多样性高于4号生理小种,Foc 1号生理小种的菌系与来自香蕉果实上的非病原尖孢镰孢菌的亲缘关系比其与Foc 4号生理小种的菌系的亲缘关系更近。     

土壤快速强烈还原对于尖孢镰刀菌的抑制作用

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f.sp.cubense,FOC)引起的一种世界性的土传病害,每年造成大量的经济损失,目前尚未找到有效的防治办法。实验采取土壤淹水及添加有机物料的方法,抑制土壤中FOC的数量。结果表明:土壤淹水处理在第5天显著增加了土壤的pH值,但随着处理时间的增加,淹水的处理中土壤pH值逐渐下降;土壤淹水及添加有机物料显著降低了土壤中SO2-4和NO-3的浓度;土壤中添加秸秆、猪粪和石灰的处理显著增加了土壤中NH+4的浓度。土壤淹水及添加有机物料对于土壤中可培养细菌数量无显著影响;但显著降低了土壤中可培养放线菌和真菌的数量;土壤淹水及添加秸秆、甘蔗渣和石灰的处理显著降低了土壤中FOC的数量,其中添加高量秸秆处理中FOC的数量下降最多,仅为处理前土壤中FOC数量的2.88%。添加有机物料但未加石灰的处理土壤中总微生物量较处理前相比显著增加。研究表明土壤淹水及添加有机物料是一种可以防控香蕉枯萎病的高效和环保的方法。     

胡麻专化型尖孢镰刀菌ISSR-PCR最佳反应体系的建立

采用正交试验设计原理,对尖孢镰刀菌ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素进行优化筛选,确立了适合尖孢镰刀菌ISSR分析的反应体系,即25μL PCR反应体积中合有20 ng模板DNA、1 U Taq酶、0.4 μmol/L引物、0.2 mmol/LdNTPs、4.0 mmol/L Mg2+和2.5 μL 10 × buffer.PCR反应最佳退火温度根据引物而定,在此基础上筛选出12条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.此研究为今后利用ISSR技术分析尖孢镰刀菌遗传多样性和群体结构奠定了基础.     

内生真菌司氏角担子菌B6对尖孢镰刀菌西瓜专化型菌株的拮抗作用

近年来,尽管西瓜产业不断发展壮大,但轮作土壤种植西瓜易产生枯萎病害导致世界范围内的西瓜严重减产。通过对峙培养实验和抑菌实验探讨了重阳木内生真菌司氏角担子菌(Ceratobasidum stevensii)B6菌株对西瓜枯萎病病原菌尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporum f. sp.Niveum,FON)的拮抗作用,并初步分析了其作用机制。平板拮抗试验的结果表明,内生真菌B6生长过程中不是通过产生抑菌带来抑制FON菌丝,而是利用自身的生长优势将FON完全覆盖。显微观察B6与FON菌丝的接触部位,发现FON菌丝外侧附着B6顶端菌丝形成的胞样结构,表明FON菌丝生长仅受到B6菌丝的抑制。抑菌试验结果显示,B6产生的挥发性物质可以抑制FON的生长和产孢,并使其菌丝分枝明显减少;B6的发酵液对FON的生长和产孢没有抑制作用。因此,推测B6主要通过释放某些挥发性物质产生拮抗作用而抑制FON的生长。     

33株尖孢镰刀菌遗传多样性的ISSR分析

为明确尖孢镰刀菌种内各菌株间的遗传差异与亲缘关系,采用ISSR分子标记技术对33株地理来源不同的尖孢镰刀菌进行了遗传多样性分析.结果表明:利用筛选出的11条引物扩增出105条条带,其中多态性条带91条,多态性位点比例为86.7％;遗传相似性与聚类分析结果供试菌株间的遗传相似系数为0.606 ～0.962,平均0.756,当遗传相似系数为0.962时,供试的33株菌可被全部区分开.表明,尖孢镰刀菌基因组在SSR区域具有丰富的多态性.寄主来源相同的供试菌株间的遗传相似性与其地理来源有一定的相关性.     

稻秸蓝藻混合厌氧发酵沼液及其化学物质对尖孢镰刀菌西瓜专化型生长的影响

研究稻秸与蓝藻(1∶1)混合厌氧发酵的沼液及其微量化学成分对尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusaruim oxysporum f.sp.niveum,FON)的孢子萌发、孢子数量、菌丝生长的影响。结果表明:40%浓度的发酵沼液即可100%抑制孢子萌发,20%浓度的沼液即可达到98.74%的抑制菌体产生孢子,100%浓度的沼液显著抑制气生菌丝的生长;进一步GC-MS分析发现沼液有机物成分中烷类较多,存在微量的四氯化碳(CCl4)、六氯乙烷(C2Cl6)、1,1-二乙氧基乙烷(CH3CH(OCH2CH3)2)3种化学物质;三者都具有显著的抑菌效果,且随浓度的增加而增大,尤其CH3CH(OCH2CH3)2的抑菌效果最好;0.75%浓度的3种化学物质对孢子萌发的抑制率即可达到100%;在培养基中分别加入CCl4、C2Cl6、CH3CH(OCH2CH3)2的浓度为1.00%时,镰刀菌的产孢数量分别降低了5.67%、18.05%、8.72%;培养4d,三者对尖孢镰刀菌西瓜专化型气生菌丝生长的抑制效果均达到90.40%,效果显著。研究表明沼液中确实存在对病原微生物具有明显抑制作用的多种有效的化学成分,可作为防治病原菌的首选药剂。     

月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌抑制作用的研究

采用生长速率法和孢子萌发法分别测定月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝生长和分生孢子萌发的抑制率,显微观察总黄酮处理尖孢镰刀菌后菌丝体形态结构的变化,并测定菌丝体相对电导率,菌丝体内超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性。结果表明:月腺大戟根总黄酮对尖孢镰刀菌菌丝生长和分生孢子萌发均有显著的抑制作用,抑制率随总黄酮浓度增加而增高,20 mg/L时抑制率达100%。总黄酮处理后的尖孢镰刀菌菌丝较细,分支减少,透明度差,液泡数量增多且形成较大的液泡;菌丝体细胞膜透性增加,SOD、CAT活性呈先上升后下降的趋势。以上实验结果可为植物病害生物防治及开发植物源农药方面提供理论依据和实验技术。     

木霉菌合成银纳米粒子条件的优化及其对甜瓜尖孢镰刀菌抑制作用

随着绿色环保观念的普及,生物合成金属纳米粒子的方法备受青睐。纳米银(Silver nanoparticles,AgNPs)由于其抗菌活性强且不易产生抗药性等特点在农业病害防治中越来越受到关注。文中利用橘绿木霉Trichoderma citrinoviride和毛簇木霉Trichoderma velutinous研究了AgNPs的最适合成条件和AgNPs对尖孢镰刀菌抑菌活性。结果表明,所有合成的AgNPs均在400–500 nm处有吸收峰,两种木霉生物合成AgNPs的最适合成条件为CL法(菌丝滤液)静置光照培养,底物AgNO₃浓度为2.0mmol/L,pH值为7,反应温度为45℃。橘绿木霉和毛簇木霉合成的AgNPs均对尖孢镰刀菌有抑制作用,抑菌效果随浓度的增加而增大,AgNPs在浓度为200 mg/L时,抑菌率分别达到33.745%和36.083%。     

滁菊连作土壤中尖孢镰刀菌的分离、鉴定及变化特征

采用传统平板培养法及尖孢镰刀菌专性培养基对滁菊连作土壤的真菌和尖孢镰刀菌进行分析测定,结果表明,在滁菊连作条件下,土壤中真菌和尖孢镰刀菌的数量显著增加,平均分别达到8.71×105 cfu/g干土和3.12×104cfu/g干土,各自是对照土壤的2.24倍和5.57倍。土壤中尖孢镰刀菌数量显著增加可能是导致滁菊连作障碍的重要因素。     

利用脂肪酸生物标记对尖镰孢寄主专化型的快速鉴定

尖镰孢寄主范围广、遗传差异大,其种下存在多种寄主专化型。对尖镰孢寄主专化型的快速鉴定可为科学制定植物病害防控策略提供依据。利用Sherlock MIS脂肪酸鉴定系统对分离自番茄、棉花、黄瓜、茄子等4种寄主专化型的18株尖镰孢进行脂肪酸成分测定,共检测到10种脂肪酸。运用SPSS软件中的PCA法对被检测到的脂肪酸进行主成分分析,确定了18:1CIS9（W9）[X1],18:2 CIS 9,12/18:0a[X2]和18:00[X3]等3个脂肪酸为其主成分。利用Bayes逐步判别法建立了尖镰孢4种不同寄主专化型判别模型为Y1=-157.750+2.809X1+3.391X2+8.099X3;Y2=-178.343+0.586X1+7.587X2- 0.214X3;Y3=-129.132+2.749X1+4.163X2+4.476X3;Y4=-201.307+2.016X1+7.345X2+2.400X3。通过对43株未知寄主专化型菌株主成分脂肪酸的测定,利用判别法对尖镰孢进行判定,结果发现有40株与原寄主来源一致,判对率达93%。表明脂肪酸生物标记法可用于尖镰孢寄主专化型的快速鉴定。     

尖孢镰刀菌全基因组测序及其致病相关基因分析

尖孢镰刀菌是导致三七根腐病的病原之一。本研究采用Illumina高通量测序技术对三七根腐病原菌(Fusarium oxysporum)的基因组扫描测序,并进行了基因组序列分析、基因功能注释和比较基因组学分析,从全基因组水平鉴定致病相关基因。扫描结果表明,基因组大小为48.12 Mb,G+C含量为51.5%,15 746个基因编码区(CDS),其中11 330个基因(71.95%)可以在COG数据库中得到其分类信息,编码有功能的蛋白6 022个。该序列已经提交GenBank数据库,登录号为SAMN09976373。进一步分析得到细胞壁降解相关基因45个,搜索数据库中F. oxysporum MAPK级联途径组分的基因序列,与酿酒酵母中MAPK级联途径进行比对并进行系统进化分析。研究结果对深入理解尖孢镰刀菌导致三七致病的分子机理,从而进一步有效控制病害的发生具有重要意义。     

尖孢镰刀菌FoHeli转座元件的结构特征及功能验证

Helitron是一种广泛存在于真核生物中的可移动遗传元件。与其他转座子不同,自主Helitron元件可编码具有复制引发（Rep）和解旋酶（Hel）结构域的转座酶,并通过滚环复制的方式在基因组中进行扩张。本研究对9种尖孢镰刀菌中的自主Helitron元件进行系统分析,结果表明尖孢镰刀菌中存在两类自主Helitron元件FoHeli1与FoHeli2。其中FoHeli1成员间序列高度相似,并具有明晰的边界特征：3’端为保守的“TATTTT”序列,其上游可形成稳定的发夹结构,且发夹上游可与5’端形成12bp的反向互补结构。基于上述分析结果,从尖孢镰刀菌Fo4287菌株中克隆获得完整的FoHeli1元件,并通过构建双元转座系统及PEG介导的原生质体转化,证明尖孢镰刀菌中的FoHeli元件可在禾谷镰刀菌PH-1菌株的基因组中发生跳转。     

红斑肢痛症继发尖孢镰刀菌感染1例

报道红斑肢痛症继发尖孢镰刀菌感染1例。患者男,9岁。双小腿、双足间歇性红肿、热、痛2a,双下肢起脓疱、溃疡20d。溃疡部位脓液真菌培养为尖孢镰刀菌。患者经口服特比萘芬和局部治疗,溃疡愈合,真菌清除。     

一株产铁载体内生细菌对尖孢镰刀菌的拮抗作用

通过改良蔗糖-天冬氨酸培养基筛选到一株产铁载体的内生细菌HS-4,测定了该菌在不同铁离子浓度下对棉花枯萎病致病菌尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的抑菌效果,并结合形态、生理生化、16S rDNA序列同源性和系统发育分析对菌株进行鉴定.结果表明:内生细菌HS-4在MSA培养基中产生荧光型铁载体,其铁载体相对含量为80%.该铁载体在低铁条件下对F.oxysporum具有抑制作用.内生细菌HS-4初步鉴定为萎缩芽孢杆菌(Ba-cillus atrophaeus).