一种用于PCR扩增的丝状真菌DNA快速提取方法

丝状真菌在工业、农业、医药以及基础生物学研究中具有重要作用。利用遗传转化技术对丝状真菌进行菌株改良和基因功能分析, 也越来越受到重视。然而, 丝状真菌DNA提取方法繁琐、费时, 难以满足利用PCR技术高通量筛选转化子的需要。本文以曲霉菌为例建立了一种快速提取丝状真菌DNA的实验方法, 微波处理置于10 × TE buffer中的菌丝即可得到DNA。RAPD试验和PCR扩增证明, 该方法提取的DNA能够达到PCR扩增的要求。研究结果为高通量快速筛选丝状真菌转化子奠定了基础。     

丝状真菌组织DNA的提取

用CTAB法直接从丝状真菌的新鲜菌丝中提取DNA,并将所提取DNA进行随机引物多态性扩增(RAPD),得到了较清晰的扩增图谱,证明该法为提取真菌DNA以用于分子生物学研究的一种有效方法。     

丝状真菌PCR模板DNA的快速制备方法

以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)为材料,旨为建立沸水浴获得PCR模板DNA的新方法。】取少量真菌菌丝置于一定体积50 mmol/L Na OH溶液中沸水浴10 min,再加入1/10体积1 mol/L Tris-HCl(p H8.0)缓冲液,12 000 r/min离心后,上清用作PCR的DNA模板。结果显示,该方法扩增效率高,扩增条带清晰,且Taq酶适应性强,适合快速制备丝状真菌的模板DNA。该方法经济、简单、快速、安全高效,可用于丝状真菌转化子的高通量筛选和菌株的快速鉴定。     

一种快速高效获取丝状真菌PCR反应模板的方法

建立一种快速高效获取丝状真菌PCR反应模板的方法,提高丝状真菌PCR鉴定效率。通过单因素法对机械破壁联合微波法进行条件优化,利用优化后的方法获取13株不同种属丝状真菌的PCR反应模板,同时与Chelex-100法、机械破壁法作对比,以试剂盒抽提法作为阳性对照,进行ITS序列扩增,琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。机械破壁联合微波法获取丝状真菌PCR反应模板的最佳条件为40 Hz机械破壁1 min、微波700 W高温裂解3 min,采取该法与试剂盒抽提法获得的模板均成功扩增13株不同种属丝状真菌ITS序列,且PCR鉴定结果一致;Chelex-100法获得的模板成功扩增6株丝状真菌ITS序列;机械破壁法获得的模板虽成功扩增9株丝状真菌ITS序列,但扩增效果欠佳。机械破壁联合微波法能够有效获取丝状真菌PCR反应模板,与试剂盒抽提法相比具有操作简便、快速高效的优点,提高丝状真菌PCR鉴定效率。     

油梨基因组DNA提取、SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

旨在建立稳定可靠的油梨(Persea americana Mill)叶片DNA的提取方法和SSR-PCR反应体系及筛选出稳定的油梨SSR多态性引物,为开展油梨种质SSR分子标记提供遗传研究的基础。以油梨叶片为试材,比较3种油梨叶片DNA提取方法 ;利用L16(45)正交实验设计对油梨SSR-PCR反应体系进行优化;利用优化的反应体系筛选引物;同时,选取5对多态性引物对45份油梨种质进行PCR扩增,进一步检测该优化体系的稳定性。结果表明,常规2×CTAB法、改良2×CTAB法和植物DNA提取试剂盒法等3种DNA提取方法中,改良2×CTAB法对油梨基因组DNA的提取效果最佳;获得最优反应体系为:20μL总反应体系中,含约40 ng DNA模板、1.5 mmol/L Mg~(2+)、0.15 mmol/L d NTPs、0.5 U Taq DNA聚合酶、0.5μmol/L引物;以此体系为基础进行引物筛选,从73对油梨SSR引物中筛选出了30对扩增条带清晰的多态性引物,说明该反应体系可用于油梨SSR标记的进一步研究;稳定性检测获得的谱带清晰,表明该优化反应体系是稳定可靠的。由此可见,改良的2×CTAB法可用于油梨叶片DNA的大量样本提取,优化后的SSR-PCR反应体系及筛选出的30对多态性引物可用于油梨SSR标记的进一步研究。     

4种黑曲霉基因组DNA提取方法的比较

目的:筛选适合提取曲霉DNA的方法.方法:比较2个菌落培养时间段(3d内和10d左右)提取DNA质量的差异;运用氯化苄法、石英砂+CTAB法、Biospin法和微波法分别提取黑曲霉基因组DNA,然后用直接电泳、浓度测定、PCR扩增等方法比较所提DNA的浓度和质量.结果:培养3d内的菌落提取的DNA纯度较高,无需纯化即可用于后续实验;4种方法制备的DNA均可用于PCR等后续实验,其中以石英砂+CTAB法提取的DNA纯度好,产率最高.结论石英砂+CTAB法是一种适用于曲霉DNA提取的简便方法.     

利用CTAB法和子囊孢子破壁法提取冬虫夏草菌DNA

通过CTAB法从冬虫夏草菌株和天然冬虫夏草不同部位提取DNA,并用PCR扩增进行验证,证明了CTAB法适合从冬虫夏草子座、菌核和冬虫夏草菌培养物中提取DNA。首次报道1种将子囊孢子破壁直接进行PCR扩增的方法,并比较了该方法和CTAB法在提取冬虫夏草DNA方面的差异。2种方法获得的DNA用于PCR扩增均能得到较好的结果。     

苛求芽孢杆菌基因组DNA提取方法的比较

目的:比较不同方法提取苛求芽孢杆菌基因组DNA的差异。方法:用经典CTAB提取法、改进CTAB法(溶菌酶处理结合CTAB提取法)、UniQ柱吸附提取法制备苛求芽孢杆菌基因组DNA,比较产物完整性和用于PCR扩增的有效性。结果:三种方法制备基因组DNA纯度接近,但改进CTAB法产率最高,UniQ法产率最低。经典CTAB法和UniQ法提取基因组DNA易降解。三种方法所得基因组DNA用于PCR扩增效率接近。结论:溶菌酶裂解结合CTAB提取更适合制备苛求芽孢杆菌基因组DNA。     

Chelex-100快速提取放线菌DNA作为PCR扩增模板

旨在建立有效扩增16S rRNA基因序列的放线菌DNA快速提取的方法。采用Chelex-100法提取放线菌DNA,使用PCR扩增16S rRNA基因序列评价提取核酸的质量。结果显示,Chelex-100法能够在10 min之内从放线菌中快速提取DNA,所提取的DNA可以直接用于PCR扩增反应,PCR扩增产物电泳条带清晰,符合理论预期结果。因此,Chelex-100法提取放线菌DNA可以作为16S rRNA基因序列PCR扩增的模板,该方法具有经济、简便、快速的特点,适合于放线菌菌株大规模地筛选和分类鉴定。     

微量植物样本的DNA提取方法研究

为建立一种适于法庭科学实践的植物物证DNA提取优化方法,以期获得高质量的适于PCR分析的模板DNA.用8种方法从不同植物的干叶片中提取DNA,利用线粒体DNA非编码区的PCR扩增结果分析评价提取DNA的质量.结果表明8种DNA提取方法所提取的DNA都可以获得线粒体DNA非编码区的PCR扩增产物,对照紫外波长扫描结果显示,以改进的CTAB方法制备的模板DNA纯度最高,可达到进口试剂盒同等制备精度,OD260/280稳定在1.7～1.9之间.因此改进的CTAB方法适用于微量植物样本的DNA提取,可应用于法庭科学实践.     

五针松胚乳ISSR-PCR反应体系的建立

采用改良的CTAB法提取5种五针松胚乳DNA,经检测,该方法提取的DNA纯度和含量较高,单粒种子胚乳DNA得率基本满足大量PCR扩增的需要。建立了稳定的、可重复的五针松ISSR-PCR最佳反应体系及PCR扩增程序,筛选出了扩增条带清晰、多态性丰富的16个ISSR引物,为今后利用五针松种子胚乳开展遗传图谱构建等分子生物学研究提供一个标准化程序。     

改良Chelex-100法快速提取转基因农产品DNA

旨在建立一种从转基因农产品中快速提取DNA的方法.分别采用改良Chelex-100法和常规CTAB法提取转基因大豆GTS40-3-2基因组DNA,测其浓度和纯度,PCR扩增其内源基因(Lectin)、启动子(CaMV35S)和品系特异性序列,对两种方法进行比较和评价,并研究两种方法提取的DNA在-20℃下保存一个月内的检测效果,以及改良Chelex-100法在玉米、小麦和水稻等其他转基因农产品的应用效果.结果表明,改良Chelex-100法能够快速在1.5h之内从样品中提取DNA,所提取的DNA直接用于PCR扩增反应,产物电泳条带清晰明亮.两种方法提取的DNA在-20℃下保存一个月内的检测效果未见明显差别.该方法在玉米、小麦和水稻等转基因农产品的应用效果稳定.因此,改良Chelex-100法提取的DNA可以作为PCR扩增模板用于转基因农产品检测.该方法具有经济、简便、快速、安全的特点,适合转基因农产品大规模筛选和鉴别.     

转基因棉籽检测中DNA模板提取方法研究

在转基因棉籽的检测中,需要得到合适的DNA模板,以进行PCR扩增。应用CTAB1,CTAB2,KIT,KIT1,SDS等五种DNA模板提取方法提取转基因棉籽中的DNA模板,根据模板DNA的OD260/OD380值,波长扫描,琼脂糖凝胶电泳,3个基因的PCR扩增结果,评价五种DNA模板提取方法的提取效果,发现以KIT1方法提取棉籽中DNA模板效果为好,可用于实际检测中。     

一种用于PCR的番茄DNA快速粗提方法

在对植物进行分子生物学研究时需要提取植物基因组DNA并对其进行PCR克隆,目前实验室常用CTAB法提取植物DNA,但其步骤相对繁琐,需要用有机溶剂反复抽提,在样本较多时,耗时较长。NaOH可以提取多种物种DNA,本研究优化了实验室条件下更加快速、经济、安全、高效的提取植物DNA的方式,主要包括以下步骤：利用液氮快速粉碎植物样品;采用碱裂解(0.5 mol/L NaOH)的方式一步提取DNA;提取的DNA利用TE缓冲液进行中和;以中和的粗提DNA作为模板进行PCR反应。本研究利用简单的DNA提取流程并结合PCR检测方式,完成了番茄转化子的快速初步鉴定。同时还证明了该NaOH法可用于番茄不同组织的DNA提取。本研究中整个操作过程步骤简单,耗时短,可在短时间内完成大量植物样品的DNA提取,无需使用氯仿、异丙醇等有毒物质,完成提取时间约为CTAB提取法的1/5,而且提取的不同组织DNA完整性较好,质量可观,满足常规的PCR检测,可用于基因克隆及转化子筛选鉴定,具有一定的利用价值和应用前景。     

RAPD分析用白花丹参叶片DNA的提取方法

本研究采用改良CTAB法和SDS法提取新鲜白花丹参叶片的基因组DNA,初步筛选RAPD扩增引物。结果表明改良CTAB法提取的DNA较SDS法质量好,随机引物p2扩增条带相对较为清晰。再利用p2随机引物对2种方法提取的DNA进行RAPD检测比较,结果显示仅改良CTAB法能扩增出有效条带,说明改良CTAB法更适合用于白花丹参基因组DNA的RAPD检测分析。本文将为白花丹参叶片DNA的提取提供方法学参考。     

PCR-RFLP和多重PCR技术检测常见病原性丝状真菌的实验研究

目的建立检测常见丝状真菌感染病原菌的PCR-RFLP和多重PCR方法。方法建立以PCR技术为基础的限制片段长度多态性(RFLP)方法 ,首先用真菌通用引物扩增丝状真菌的ITS区,然后用限制性核酸内切酶对PCR产物进行酶切。用4种丝状真菌的特异性引物建立多重PCR体系,用该体系检测单模板、双模板和三模板的扩增情况,并测定该体系的特异性和敏感性。结果用PCR-RFLP技术能够鉴别5种常见丝状真菌,多重PCR能够根据扩增片段的不同鉴别菌种,在合适的反应条件下,对单模板、双模板和三模板均能扩增出目的片段。结论 PCR-RFLP和多重PCR技术能够快速鉴定丝状真菌感染病原菌,有临床应用的良好前景。     

落羽杉属树木基因组总DNA的提取及SRAP反应体系的优化

本文针对落羽杉属植物组织中多糖、多酚等次生物质含量高的特点,对其基因组DNA提取方法进行研究,比较了SDS法、CTAB法提取落羽杉属植物基因组DNA的效果,结果表明:CTAB法提取效果较佳.在此基础上,利用正交设计法,对SRAP反应体系中的各个主要影响因子Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶进行了优化筛选,确立了适合落羽杉属植物SRAP-PCR反应的最佳体系,即10 μL体系中含有1 μL10×PCR buffer,Mg2+ 2.0 mmol/L,dNTP 100 μmol/L,引物0.3 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.5 U和50 ng模板DNA.利用该优化体系,通过48对SRAP引物组合对2个落羽杉属植物(落羽杉和墨杉)及4个杂交后代进行SRAP扩增,结果发现,SRAP引物及优化后的反应体系能够有效地用于落羽杉属植物种质资源鉴定及遗传多样性分析等研究.     

古DNA实时荧光定量PCR实验中标准品的制备

实时荧光定量PCR技术通过对PCR每一循环扩增产物的实时检测,可对模板的精确拷贝数进行绝对定量,从而用于古DNA实验中提取和扩增条件的比较和优化.本研究采用异硫氰酸胍碱裂解-SiO2吸附的方法,从采自黑龙江省的晚更新世斑鬣狗化石材料中提取得到了斑鬣狗线粒体基因组古DNA.经常规PCR扩增后,将纯化的扩增产物克隆到微生物体内使其大量复制,再用M13通用引物扩增出含少量外源DNA的古DNA目标片段,从而建立了适用于古DNA荧光定量PCR扩增的标准品的制备方法.经检测分析,运用该方法制备的标准品性质稳定,能够准确地指示反应体系中较为精确的古DNA模板拷贝数,从而反映古DNA的提取和扩增效率,用于比较并优化古DNA提取和扩增条件.     

中科灵芝核糖体大亚基(LSU)基因组的序列测定和分析

采用先进的CTAB法提取中科一号灵芝菌株的基因组DNA,经过LSD序列的扩增,引物设计,PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测后用试剂盒回收,转化大肠杆菌感受态细胞,获得正确的转化子后,测序,获得新的灵芝rDNA序列.     

烟草碱法提取基因组DNA的改进

为能够快速高效的对大量转基因烟草样品进行DNA提取,对碱法提取烟草组织DNA的方法进行了改进。采用0.01mol/L的Na OH溶液为提取液,破碎转基因烟草叶片组织后无需经过加热煮沸中和等步骤,上清液可直接用作PCR反应的模板。结果表明,0.01-0.1 mol/L之间的Na OH溶液制备的DNA模板均能成功扩增,该方法制备的DNA模板不依赖特殊的反应条件,多种品牌的PCR Mix均能成功进行扩增反应。与传统SDS提取法和试剂盒提取法获得的DNA相比,PCR结果没有明显差异。此提取方法在小麦、高粱、水稻、玉米等作物上也取得了很好的实验效果。通过本方法制备的DNA模板,其PCR扩增的产物可直接用来测序分析。该方法使用仪器少,样品消耗少,快速、简便、成本低,没有交叉污染,能够在短时间内处理大量样品,因此能够对大量的转基因烟草样品进行DNA的快速提取和鉴定。