肾综合征出血热双价纯化疫苗（Vero细胞）安全性的研究

在肾综合征出血热（HFRS）双价纯化疫苗（Vero细胞）的研制中,对病毒培养用Vero细胞致瘤性和试制疫苗的过敏原性进行了动物实验研究,结果表明,病毒培养用Vero细胞无致瘤性,三批试制疫苗无过敏原性。说明用Vero细胞为培养介质的HFRS双价纯化疫苗是安全的。     

不同来源的肾综合征出血热病毒对Vero细胞的致病变作用

前文报道,肾综合征出血热病毒76-118株能使Vero细胞产生病变。本文报道76-118株和另11株不同来源的肾综合征出血热病毒(H537、A9、H5、R178、HB55、R22、Z10,沟3、L99、A16和J10)对Vero细胞的致病变作用(CPE )。其中除沟3株外,大部分毒株在感染Vero细胞后的第一代即可见明显的CPE。CPE的特点与76-118株相似,主要是感染细胞粘聚、融合,形成网状结构。CPE能被特异性抗HFRS病毒血清和型特异性单克隆抗体所中和抑制,但不能被特异性抗呼肠孤病毒Ⅲ型免疫血清所中和抑制。HFRS病毒对Vero细胞的致病变作用,对进一步研究HFRS病毒的某些生物学特性及实验方法等均有重要意义。     

肾综合征出血热Vero细胞疫苗毒种的选育及生物学特性研究

在肾综合征出血热(HFRS)疫苗Vero细胞毒种研制中,将肾综合征出血热(HFRS)病毒PS-6(Ⅰ型)、L99(Ⅱ型)在Vero细胞上连续传代,并对其病毒滴度、免疫原性、传代稳定性等进行检测。结果显示,两株病毒在Vero细胞上传代适应后,病毒滴度达8.5 lgCCID50/m l,免疫原性检查,将病毒灭活制成疫苗免疫家兔的血清中和抗体效价>1:10,其他检测符合规程要求。因此,适应的PS-6(Ⅰ型)和L99(Ⅱ型)毒种可用于制备Vero细胞出血热疫苗。     

用Vero E—6细胞从病人血清中直接分离肾综合症出血热病毒

用从美国引进的 Vero E—6细胞株接种肾综合症出血热(HFRS)病人的早期血清标本19份,全血4份,从中分离出21株与 HFRS 相关的病原体。分离阳性率达91.3%。用感染细胞制成的滴片标本经免疫荧光染色检查,在21份阳性的材料中有颗粒状(15份)及片状(6份)两种形态的特异性荧光,从这些分离出的病毒株中选2种不同形态的“H8205”及“H8278”病毒株进行了系统鉴定。结果排除了呼肠、疱疹、新疆出血热、森林脑炎等病毒。证明这两种形态的荧光都是分离出 HFRS 病毒引起的特异性荧光。肾综合症出血热病原分离自1978年 Lee 等用黑线姬鼠分离传代成功以后,我国学者宋干、严玉辰等人最近也从黑线姬鼠、褐家鼠中分离到 HFRS 病原相关因子,并适应于 A549及 Vero E—6细胞中,但从目前的文献报告中尚未见到用 VeroE—6细胞从患者血清中直接分离出 HFRS 病毒的报告。本文介绍1982年4—12月我们用 Vero E—6细胞直接从病人血清中分离 HFRS 病毒及对所分离出的病毒株的鉴定结果。     

肾综合征出血热双价灭活疫苗的研究

为研制包含Ⅰ型和Ⅱ型病毒抗原的肾综合征出血热双价灭活疫苗,以适合全国各出血热疫区使用,通过空斑克隆和终末稀释传代的方法选育了2株出血热Ⅰ型病毒PS-6和JR-C-1。用金黄地鼠肾细胞培养的L99株（Ⅱ型）病毒疫苗,PS-6株病毒疫苗和JR-C-1株病毒疫苗以2：1：1的配伍方式试制三批双价疫苗,结果试制的三批双价疫苗自检和中国药品生物制品检定所复检,各项指标全部合格,疫苗于室温放置3周,37℃放置2周和4℃放置1年、1.5年和2年,效力试验均合格,研制的三批出血热双价疫苗,符合《肾综合征出血热灭活疫苗（双价）试行规程》的要求,疫苗稳定性良好。     

汉坦病毒受体

汉坦病毒感染可引起两种严重威胁人类生命的传染性疾病:肾综合征出血热(HFRS)和肺综合征出血热(HPS)[1,2],这两种疾病都与急性血小板减少和血管渗透性变化有关[3].因此,弄清汉坦病毒与宿主细胞的相互作用及其机制,对控制汉坦病毒性疾病显得尤为重要.整合素对维持血管壁的渗透性和完整性具有重要作用.一种整合素可以在不同的细胞上表达,同一种细胞也可以表达多种不同的整合素,并且不同类型整合素的作用也各有不同.在汉坦病毒与内皮细胞相互作用研究中,细胞整合素受体起到了关键性的作用,致病性汉坦病毒通过细胞膜上β3整合素感染细胞,而非致病性汉坦病毒通过细胞膜上β1整合素感染细胞[4,5].这些都为汉坦病毒的受体和发病机制研究奠定了一定的基础.本文拟对该研究近况作一综述,为汉坦病毒致病机制的深入研究提供参考.     

汉滩病毒S片段基因编码区在Vero—E6细胞中的表达

汉滩病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属,主要引起人类肾综合征出血热［１］。我国是肾综合征出血热发生和流行的主要疫区,该病起病急、病死率高,流行范围广,因此寻找安全有效、低廉的疫苗是控制本病流行和发生的关键。基因免疫是近年来微生物学和免疫学研究的新热点［２...     

反转录病毒MSCV介导汉坦病毒核蛋白基因在NIH3T3细胞中整合和表达

汉坦病毒是引起肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒型肺炎综合征(HPS)的主要病原体.由S基因编码的核蛋白(NP)主要与机体的细胞免疫有关,并调节病毒的复制及诱导细胞程序性死亡.构建了汉坦病毒Z10株核蛋白cDNA与含有pac基因的反转录病毒鼠干细胞病毒(MSCV)重组体MSCV-FlagNP,通过磷酸钙转录法导入产病毒的包装细胞系BOSC23中,产生完整的重组MSCV-FlagNP病毒.然后以重组病毒感染NIH 3T3细胞,利用Puromycin的选择特性(pac基因)对感染细胞进行连续压力筛选,获得了转核蛋白抗性细胞.利用Southern blot和PCR方法分别对核蛋白基因在抗性细胞染色体整合情况及其完整性进行了鉴定.并且用Western blot在抗性细胞中可检测到核蛋白的表达.进一步以Flag单克隆抗体介导的免疫荧光染色联合共聚焦激光扫描荧光显微镜,分析了内源性Flag融合核蛋白在抗性细胞内分布,发现核蛋白主要分布于胞浆及胞核周围区,并且部分核蛋白可聚集形成胞浆包涵体.转核蛋白基因细胞模型的建立,对进一步研究汉坦病毒核蛋白功能以及病毒复制机制有重要意义.     

基因芯片技术检测肾综合征出血热病毒核酸的研究

肾综合征出血热 (Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)是由布尼亚病毒科汉坦病毒属 (Hantavirus,HV)中的病毒引起的急性传染病,该病的病死率较高,早期诊断和治疗尤为重要.     

汉坦病毒的致病性和免疫应答以及抗病毒和疫苗研究进展——第四 …

第四届肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）和汉坦病毒国际会议于１９９８年３月５日￣７日在美国亚特兰大召开,会议共有９个专题。本文就汉坦病毒的致病性和免疫应答以及疫苗和抗病毒药物的研究现状以及最新进展作一简单介绍：研究较为深入的有美国引起汉坦病毒肺综合征的Ｓｉｎ Ｎｏｍｂｒｅ病毒,致今已确诊病例１７０多例,它的致病机理认为是由Ｔ细胞介导的免疫病理所致,而与我国由ＨＴＮ病毒引起的肾综合征出血热是由抗原抗体复合物     

应用柱层析法纯制Vero细胞肾综合征出血热疫苗

从Vero细胞培养液中提纯培养的汉滩病毒,将细胞冻融后上清液过Sepharose4FF凝胶层析柱,经紫外线280nm波长检测到三个吸收峰,RPHA证实仅第一峰为病毒抗原峰,另二个峰为杂蛋白,实验说明Sepharose4FF凝胶过滤对于提纯HFRS汉滩病毒是非常有效的,能去除98%的杂蛋白。     

肾综合征出血热Ⅱ型疫苗(L99株)免疫效果及对Ⅰ型病毒攻击的保护作用

为探讨Ⅱ型肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）疫苗的实际流行病学免疫效果及对姬鼠型ＨＦＲＳ的交叉保护作用,我们选择混合型疫区为研究现场,应用Ⅱ型ＨＦＲＳ疫苗（Ｌ９９株）进行人群接种观察,研究结果表明,该疫苗对以家鼠型为主的混合型疫区具有明显的保护效果,保护率为１００％,接种组家鼠型和姬鼠型ＨＦＲＳ的理论发病数和实际发病数间均具有显著性差异（Ｐ值分别为Ｐ＜０．０５,Ｐ＜０．０１）,由此可见,Ⅱ型ＨＦＲＳ苗（Ｌ９９株）除适合家鼠型疫区外,还可在混合型疫区和姬鼠型疫区推广使用     

Efficacy of Single Dose of a Bivalent Vaccine Containing Inactivated Newcastle Disease Virus and Reassortant Highly Pathogenic Avian Influenza H5N1 Virus against Lethal HPAI and NDV Infection in Chickens

Highly pathogenic avian influenza (HPAI) and Newcastle disease (ND) are 2 devastating diseases of poultry, which cause great economic losses to the poultry industry. In the present study, we developed a bivalent vaccine containing antigens of inactivated ND and reassortant HPAI H5N1 viruses as a candidate poultry vaccine, and we evaluated its immunogenicity and protective efficacy in specific pathogen-free chickens. The 6∶2 reassortant H5N1 vaccine strain containing the surface genes of the A/Chicken/Korea/ES/2003(H5N1) virus was successfully generated by reverse genetics. A polybasic cleavage site of the hemagglutinin segment was replaced by a monobasic cleavage site. We characterized the reverse genetics-derived reassortant HPAI H5N1 clade 2.5 vaccine strain by evaluating its growth kinetics in eggs, minimum effective dose in chickens, and cross-clade immunogenicity against HPAI clade 1 and 2. The bivalent vaccine was prepared by emulsifying inactivated ND (La Sota strain) and reassortant HPAI viruses with Montanide ISA 70 adjuvant. A single immunization with this vaccine induced high levels of hemagglutination-inhibiting antibody titers and protected chickens against a lethal challenge with the wild-type HPAI and ND viruses. Our results demonstrate that the bivalent, inactivated vaccine developed in this study is a promising approach for the control of both HPAI H5N1 and ND viral infections.     

A Recombinant Measles Vaccine Virus Expressing Wild-Type Glycoproteins: Consequences for Viral Spread and Cell Tropism

Wild-type, lymphotropic strains of measles virus (MV) and tissue culture-adapted MV vaccine strains possess different cell tropisms. This observation has led to attempts to identify the viral receptors and to characterize the functions of the MV glycoproteins. We have functionally analyzed the interactions of MV hemagglutinin (H) and fusion (F) proteins of vaccine (Edmonston) and wild-type (WTF) strains in different combinations in transfected cells. Cell-cell fusion occurs when both Edmonston F and H proteins are expressed in HeLa or Vero cells. The expression of WTF glycoproteins in HeLa cells did not result in syncytia, yet they fused efficiently with cells of lymphocytic origin. To further investigate the role of the MV glycoproteins in virus cell entry and also the role of other viral proteins in cell tropism, we generated recombinant vaccine MVs containing one or both glycoproteins from WTF. These viruses were viable and grew similarly in lymphocytic cells. Recombinant viruses expressing the WTFH protein showed a restricted spread in HeLa cells but spread efficiently in Vero cells. Parental WTF remained restricted in both cell types. Therefore, not only differential receptor usage but also other cell-specific factors are important in determining MV cell tropism.     

汉滩病毒84Fli株DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的初步研究

为了加强我国病毒性出血热的防治,本研究将汉滩病毒84Fli株核蛋白S和糖蛋白M编码片段分别克隆至pcDNA3.0载体,构建了pcDNA3/84S和pcDNA3/84M重组质粒,等量混合采用肌肉注射途径免疫C57BL/6小鼠,免疫3次,每次间隔2周,同时与双价出血热病毒灭活疫苗进行对比。ELISA及免疫荧光(IFA)分别检测小鼠血清中汉滩病毒核蛋白及糖蛋白特异性抗体,流式细胞仪和ELISPOT方法分析小鼠免疫后的细胞免疫水平。微量中和试验检测小鼠血清抗体的的中和活性。结果显示,DNA疫苗免疫组C57BL/6小鼠在初次免疫2周后即能检测到汉滩病毒核蛋白与糖蛋白的特异性抗体,与灭活疫苗组相比,重组质粒诱导的抗体滴度高,产生时间早,产生的抗体具有中和活性;同时可诱导产生特异性细胞免疫应答。研究表明,汉滩病毒pcDNA3/84S和pcDNA3/84M重组质粒能有效刺激小鼠产生特异性体液免疫和细胞免疫应答。     

A Novel Bivalent Vaccine Based on a PB2-Knockout Influenza Virus Protects Mice from Pandemic H1N1 and Highly Pathogenic H5N1 Virus Challenges

Vaccination is an effective means to protect against influenza virus. Although inactivated and live-attenuated vaccines are currently available, each vaccine has disadvantages (e.g., immunogenicity and safety issues). To overcome these problems, we previously developed a replication-incompetent PB2-knockout (PB2-KO) influenza virus that replicates only in PB2 protein-expressing cells. Here, we generated two PB2-KO viruses whose PB2-coding regions were replaced with the HA genes of either A/California/04/2009 (H1N1pdm09) or A/Vietnam/1203/2004 (H5N1). The resultant viruses comparably, or in some cases more efficiently, induced virus-specific antibodies in the serum, nasal wash, and bronchoalveolar lavage fluid of mice relative to a conventional formalin-inactivated vaccine. Furthermore, mice immunized with these PB2-KO viruses were protected from lethal challenges with not only the backbone virus strain but also strains from which their foreign HAs originated, indicating that PB2-KO viruses with antigenically different HAs could serve as bivalent influenza vaccines.     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G1基因重组腺病毒载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

拟构建汉坦病毒Gl基因重组腺病毒载体并在VeroE6细胞中表达,为汉坦病毒基因疫苗的研究提供实验基础。PCR法从含汉坦病毒-76118株M基因的M56质粒扩增糖蛋白G1基因片段,利用穿梭质粒pShuttle,将其克隆入Adeno—X病毒DNA,获得重组腺病毒DNA,转染HEK293细胞,包装、扩增后得到汉坦病毒Gl基因重组腺病毒原种,感染VetoE6细胞,用IFA法和ELISA法检测表达产物。得到了含汉坦病毒G1基因的重组腺病毒,其滴度约为10^11pfu／ml,感染VeroE6细胞后检测到汉坦病毒糖蛋白G1的表达。