人感染新型H10N3禽流感病毒分子溯源

【背景】1997年香港发生人感染禽流感事件以来,禽流感病毒成为持续威胁人类健康和公共卫生的重要病原体。【目的】对一例人感染新型H10N3禽流感病毒病例开展分子溯源研究。【方法】流感病毒分型检测采用RT-qPCR法,在下一代测序平台上完成病毒基因组测序,序列和系统进化分析采用BLAST和MEGA 6.1等生物信息学软件。【结果】2021年4月从严重呼吸道疾病患者体内分离到一株病毒,经核酸检测和序列分析,结果表明其为H10N3亚型禽流感病毒。从患者居所附近的农贸市场分离到一株基因高度同源的H10N3亚型禽流感病毒。分离株是一种新的基因重配H10N3禽流感病毒,其血凝素hemagglutinin(HA)和神经氨酸酶neuraminidase(NA)组合最早在2019年华东地区的家禽中检测到,6个内部基因来源于近年来中国南方家禽中流行的H9N2病毒。病毒的HA蛋白的裂解位点含有1个碱性氨基酸R,未插入多个碱性氨基酸,理论上不属于高致病性禽流感病毒。HA蛋白受体结合位点228位氨基酸残基由G突变为S,理论上增强了对人SAα2,6受体的亲和力。另外,未发现PB2蛋白E627K突变,但591位氨基酸...     

一株H3N2亚型猪流感病毒广东分离株的基因组序列分析

从广东省疑似流感发病猪分离到1株H3N2亚型猪流感病毒(A/Swine/Guangdong/01/2005(H3N2)),对其各个基因进行克隆与测序,并与GenBank中收录的其它猪流感、禽流感和人流感的相关基因进行比较,结果表明,HA全基因与广东2003~2004年分离的H3N2猪流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上,与纽约90年代末分离的H3N2人流感毒株同源性在98.5%以上;NA基因与纽约1998~2000年分离的H3N2人流感毒株的核苷酸序列同源性在99%以上;NS基因、M基因的核苷酸序列与H1N1亚型猪流感毒株A/swine/HongKong/273/1994(H1N1)的核苷酸序列同源性较高,分别为97.9%、98.4%,与美洲A/swine/Iowa/17672/1988(H1N1)的核苷酸序列同源性分别为96.7%、97.1%;其他基因的核苷酸序列与H3N2人流感毒株具有很高的同源性。因此,推测其M和NS基因来源于H1N1亚型猪流感病毒,HA、NA及其他基因均来源于H3N2亚型人流感病毒。表明此H3N2亚型猪流感病毒为H3N2亚型人流感病毒和H1N1亚型猪流感病毒经基因重排而得到的重组病毒。     

鹌鹑源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定及其生物学特性研究

本研究从人感染H7N9活禽交易市场的鹌鹑体内分离到1株H9N2亚型流感病毒并命名为A/Quail/Hangzhou/1/2013(H9N2),并分析了该毒株的基因组特性及其对鸡的致病力。序列分析结果显示:基因组中HA、NS基因属于类CK/BJ/1/94分支,NA、NP、PA、PB1基因属于类SH/F/98分支,M和PB2属于类G1/97分支。关键氨基酸位点分析结果显示:HA的裂解位点为PSRSSR↓GL,HA蛋白具有人样流感病毒受体结合位点Leu226,NA颈部出现63-65位氨基酸的缺失,M2蛋白Asn31和NS1蛋白Ser42、Ala149发生了突变。该毒株的IVPI为0.36。雏鸡感染性试验的结果显示:所有接种鸡在感染后的第3天从呼吸道和消化道都可检测到排毒,直至第11天停止排毒。同居感染动物于放入后的第2天达到排毒高峰,排毒率为100%,持续至第8天停止排毒。感染动物的病毒再分离结果显示:肺和气管的带毒时间可达5天,其他组织为3天。以上结果表明:该毒株是一株H9N2大陆流行谱系的低致病性禽流感病毒。本研究为H9N2亚型禽流感病毒的预防和监控提供了一定的理论依据。     

一株人感染高致病性禽流感(H5N1)病毒基因组分子特征分析

【背景】H5N1禽流感病毒可以感染人类导致重症呼吸道感染,致死率高。【目的】研究我中心确认的一例人感染高致病性禽流感H5N1病毒A/Nanjing/1/2015的可能起源及基因组分子特征。【方法】对病人痰液样本中的H5N1病毒进行全基因组测序,使用CLC Genomics Workbench 9.0对序列进行拼接,使用BLAST和MEGA 5.22软件进行同源性比对和各片段分子特征分析。【结果】该株禽流感病毒属于H5亚型的2.3.2.1c家系,其8个片段均与江浙地区禽类中分离的病毒高度同源,未发现有明显的重配。分子特征显示,该病毒血凝素(Hemagglutinin,HA)蛋白裂解位点为PQRERRRR/G,受体结合位点呈现禽类受体特点,但出现D94N、S133A和T188I氨基酸置换增强了病毒对人类受体的亲和性。神经氨酸酶(Neuraminidase,NA)蛋白颈部在49-68位缺失20个氨基酸,非结构蛋白1 (Non-structure protein,NS1)存在P42S置换和80-84位氨基酸的缺失。其他蛋白中也存在多个增强病毒致病力和对人类细胞亲和力的氨基酸突变。对耐药位点分析发现存在对奥司他韦的耐药突变H_274Y,病毒对金刚烷胺仍旧敏感。【结论】人感染高致病性禽流感H5N1病毒A/Nanjing/1/2015属于2.3.2.1c家系,禽类来源,关键位点较保守,但仍出现了多个氨基酸的进化与变异使其更利于感染人类。H5N1禽流感病毒进化活跃,持续动态监测不能放松。     

2019-2020年苏中地区某活禽市场H9N2禽流感病毒分子进化

【背景】20世纪90年代以来,H9N2禽流感病毒成为危害我国养禽业及人类健康和公共卫生的重要病原。【目的】了解苏中地区2019-2020年活禽市场H9N2禽流感病毒的分子进化特征。【方法】通过荧光定量PCR法对标本进行流感病毒分型检测,原始标本用SPF鸡胚进行病毒分离,用特异性引物对病毒分离物进行全基因组测序,利用BLAST、ClustalX和MEGA6等软件进行序列比对和系统发育分析。【结果】2019-2020年间从苏中地区某农贸市场采集到231份环境和禽类标本,共检出34份甲型流感病毒,其中33份为H9N2亚型。阳性标本接种SPF鸡胚,分离到20株H9N2病毒。对其中11株病毒进行全基因组测序,系统发育分析表明11株病毒的HA和NA都属于H9N2禽流感Y280-like系的G57基因型。根据HA和NA的进化特征,11株病毒可分为5个基因组合(A、B、C、D和E),其中A (n=5)是优势流行基因组合。11株H9N2分离病毒的HA蛋白HA1和HA2亚单位的裂解位点是一个碱性氨基酸R,具有低致病性禽流感病毒的特征。HA蛋白的受体结合部位有4个氨基酸位点(I155T、H183N、A190...     

2013～2014年度中国H3N2亚型流感病毒病原学特征分析

为分析2013~2014流感监测年度中国大陆地区H3N2亚型流感病毒的抗原性和基因变异情况,本文选择了本监测年度中国分离的H3N2亚型流感病毒,利用标准雪貂抗血清进行抗原性分析,利用Sanger测序法进行病毒基因测序,采用邻位相临法(Neighbor-Joining,N-J)方法进行种系进化分析,分析我国H3N2亚型流感病毒的变异情况,进一步比较其与疫苗株的匹配性。抗原分析显示,本监测年度H3N2亚型流感病毒大部分为疫苗株A/Victoria/361/2011细胞株的类似株(99.6%),但以A/Texas/50/2012鸡胚株为参考抗原,只有15.1%为类似株,仅有11.9%与中国流行株的鸡胚分离株A/Shanghai-Changning/1507/2012抗原性类似。HA基因特性分析显示我国毒株均位于同一大分支,NA基因没有发现与耐药性相关的氨基酸位点突变。总之,2013~2014流感监测年度我国H3N2亚型流感病毒在流行过程中未发生明显变异,但病毒在鸡胚中传代会导致关键氨基酸位点变异。应及时分析并发现我国病毒的抗原性和基因特性变异情况,推选出更适合我国的疫苗株。     

我国首例孕妇感染高致病性禽流感(H5N1)的病原学研究

对2005年11月8日安徽省铜陵市人民医院报告的一例孕妇不明原因肺炎病例的死亡病因进行研究。采集病人的气管吸出物及血液标本,用RT-PCR和Real-ti me PCR方法检测流感病毒A/M、A/H5N1、A/H7N7、A/H9N1亚型特异性核苷酸片段;气管吸出物接种SPF鸡胚进行病毒分离,并对分离物进行鉴定和序列测定及分析;利用血凝抑制试验检测血清标本抗体。结果表明病人气管吸出物可以检测到甲型流感病毒M片段及H5亚型的特异性HA基因。2005年11月9日采集的血清标本用Real-ti me PCR检测到甲型流感病毒M基因。从病人的气管吸出物中分离到H5N1病毒(A/Anhui/1/2005),对病毒的HA基因序列结果进行分析表明病毒是禽源的,其主要依据是受体结合位点第226~228位氨基酸位点(QSG)为禽流感病毒所特异,HA受体连接肽仍为9个碱性氨基酸(LRERRRKRP);基因进化树分析显示,HA基因与禽源病毒进化距离接近。发病后7、8、9d的血清H5N1禽流感病毒HI抗体小于20。对该病例的病原学研究证明,该病例为H5N1禽流感感染病例。     

禽流感病毒H9N2在人肺组织的复制

禽流感病毒H9N2亚型在多种陆禽流行并反复感染哺乳动物猪和人,其对公共卫生安全呈潜在巨大威胁。本文应用体外禽流感病毒H9N2亚型感染人肺组织和免疫组化实验,探讨禽流感病毒H9N2亚型跨种间感染人的机制、H9N2病毒在人肺组织复制特性及组织嗜性。结果显示,禽流感病毒H9N2亚型(Ck/GX/1875/04、Ck/GX/187/05)和季节性人流感病毒H3N2亚型(A/ST/602/05)均可感染人肺组织;免疫组化检测流感病毒核蛋白(Nucleoprotein,NP),病毒复制的主要靶细胞为肺泡细胞、呼吸细支气管上皮细胞和细支气管上皮细胞;免疫组化和免疫荧光双重染色法检测流感病毒感染肺泡类型,禽流感病毒H9N2亚型感染II型肺泡细胞。结果提示,禽流感病毒H9N2可适应宿主人以及在人肺上皮细胞有效复制,病毒持续感染人有助于病毒基因进化进而演变成大流行新型流感病毒的潜能。     

H3N2亚型猪流感病毒的拯救及HA与NA基因的替换

摘要：【目的】为研究流感病毒突破种间屏障分子机制,筛选流感基因工程疫苗株。【方法】本实验以猪流感病毒A/Swine/Henan/S4/01(H3N2)为亲本株,利用反向遗传学操作技术,采用RT-PCR技术对该病毒的8个基因片段分段进行扩增,通过与双向转录载体pHW2000连接, 重组质粒转染293T和MDCK共培养细胞,拯救出全部基因均来自于亲本株的猪流感病毒rgH3N2,并分别以人流感病毒A/ PR/8/34(H1N1)、禽流感病毒A/Duck/Nanchang /4-165/2000 (H4N6 )、马流感病毒A/Equine/Fuyun/2008/(H3N8)的HA和NA基因替换A/Swine/Henan/S4/01的相应基因,【结果】生物学实验结果表明rgH3N2在鸡胚半数感染量、组织培养半数感染量、稳定性试验等方面都与亲本株保持一致。rgH3N2经鸡胚多次传代后血凝价最高可达到1:256,接种MDCK细胞60 h后,血凝价可以达到1:64。基因替换后成功拯救出的重组病毒rgH1N1、rgH4N6和rgH3N8在鸡胚和细胞上均具有较高的增殖能力。【结论】病毒的成功拯救为流感病毒突破种间屏障分子机制,HA、NA基因在流感病毒跨种属传播中所扮演角色的研究和流感基因工程疫苗株的筛选奠定了基础。     

共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力

为了构建更为安全有效能同时抵抗高致病性H5亚型和低致病忡H9亚型禽流行性感冒(禽流感)病毒的基因工程疫苗,将H5和H9亚型禽流感病毒分离株的血凝素(HA)基因,分别由鸡痘病毒早晚期启动子PS和PE／L调控其转求,定向插入鸡痘病毒转移载体p11s中,获得H5A和H9A基因分别处于PS及PE／L启动子转录调控下的重组转移载体p11SH5H9。以FuGene^TM6转染法将p11SH5H9转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中。p11SH5H9与wt—FPV基因组DNA之间的同源重组产生了重组鸡痘病毒rFPV11SH5H9。通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-11SH5H9。以间接免疫荧光法试验证实,纯化的rFPV-11SH5H9感染的CEF能同时表达H5A和H9A。初步的动物试验表明,用10^5PFU的rFPV-11SH5H9免疫无特定病原体(SPF)鸡,免疫后血凝抑制(HI)抗体监测阳性率均为100％(8／8);该重组病毒能显著抑制H9亚型AIV滴鼻、点眼后7日龄SPF鸡从气管和泄殖腔排毒,同时也能抵抗H5亚型AIV肌肉注射后对7日龄SPF鸡致死性攻击,保护率均为100％,显示出一定的应用前景。     

A/H1N1流感—世界关注的焦点

2009年4月,A/H1N1流感在墨西哥和美国暴发。随后,疫情迅速蔓延到美洲、欧洲、亚洲多个国家。A/H1N1流感病毒是一种以前在人或动物身上从未观测到的新病毒。遗传进化和抗原特性分析表明该病毒和猪流感病毒密切相关,与人类的季节性流感病毒有明显区别。但是流行病学信息表明A/H1N1流感病毒只攻击人类,并在人与人之间传播,尚未发现动物向人类传播的情况。本文从A/H1N1流感病毒的生物学特性、临床特征、公共卫生意义等方面全面阐述了A/H1N1流感的最新研究进展,为正确认识和科学防控A/H1N1流感提供参考。     

上海地区H9N2亚型禽流感病毒的遗传演化分析

为阐明上海地区 H9N2亚型禽流感病毒分离株的遗传变异、分子特征和重组模式,选取2002和2006～2014年分离自活禽市场、家禽养殖场和生猪屠宰场的14株 H9N2亚型禽流感病毒进行分析。这14株病毒分别来源于鸡、鸭、鸽、野鸡咽喉和泄殖腔样品及猪肺脏样品,用 H9亚型荧光反转录‐聚合酶链反应（RT‐PCR）试剂盒检测后,阳性样品经无特定病原体（SPF）级鸡胚尿囊腔接种并分离病毒,用血凝抑制（HI）实验进一步确定其血凝素（HA）亚型。RT‐PCR分别扩增这14株病毒全基因并进行序列测定,分析8个基因片段的遗传发生关系,发现这些分离株主要由 F／98亚系、Y280亚系、G1亚系及未知亚系重组而成。根据8个基因片段的组合情况,这14株病毒可分成5个基因型。2002、2006～2008年分离的5株H9N2亚型禽流感病毒代表了4个不同基因型,2009～2014年分离的9株H9N2亚型禽流感病毒属第5种基因型,推测可能与疫苗免疫选择压力有关。因此,在以后工作中加强H9N2亚型禽流感分子流行病学监测是非常必要的。     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆与表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因(na)序列设计、合成克隆引物。自H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增na基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTMpETdirectionalTOPOexpressionsystem)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组神经氨酸酶,分子量约53.8kDa。分析重组NA的免疫反应性和免疫原性,结果表明:重组NA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免异动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性。     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆与表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因(na)序列设计、合成克隆引物.自H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增na基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTM pET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组神经氨酸酶,分子量约53.8kDa.分析重组NA的免疫反应性和免疫原性,结果表明重组NA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免异动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性.