胚胎神经细胞的培养方法与应用

体外胚胎神经细胞培养与在体神经细胞在神经发育生物学的研究中相辅相承，不断推动神经科学的发展。神经细胞原代培养涉及神经细胞的分离纯化、培养基的成分及观测方法等。本文对国内外近年来胚胎神经细胞的培养方法及应用进行了简单的综述。     

神经上皮干细胞的分离培养及其体外分化特性的观察

目的探讨大鼠胚胎神经管神经上皮干细胞的分离培养条件,并观察其在体外的分化特性.方法采用显微解剖、机械吹打、无血清悬浮培养方法分离培养神经上皮干细胞,采用巢蛋白(nestin)免疫细胞化学染色技术检测神经上皮干细胞,用NSE和GFAP免疫组化染色检测并计数神经细胞和神经胶质细胞.结果大鼠胚胎神经管神经上皮干细胞在无血清培养基中可形成大量呈nestin抗原阳性细胞构成的神经球,经传代有血清培养后分化为NSE阳性和GFAP阳性细胞,其中NSE阳性细胞占细胞总数的47.7%,GFAP阳性细胞占细胞总数的39.8%.结论胎鼠神经管神经上皮干细胞在无血清培养中可增殖和传代,在有血清培养中可分化为神经细胞和神经胶质细胞,两者之比为47.7∶39.8.     

NGF 对大鼠胚胎中脑神经细胞体外增殖和分化的影响

目的:探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对大鼠胚胎中脑神经细胞体外增殖和分化的影响。方法:在体外分离培养大鼠胚胎中脑神经细胞的培养液中加入不同浓度(10、50、100、200ng/ml)的NGF,培养不同时间,以不加神经营养因子的细胞为对照组,通过MTT法检测细胞活性,神经元特异性烯醇化酶免疫细胞荧光技术鉴定神经细胞,光镜下形态学观察各组大鼠中脑神经细胞体外增殖和分化情况。结果:胚胎中脑神经细胞胞体增大、突起延长且有丰富的神经纤维连结成网络状,细胞集落数增加,显示出剂量-效应关系。结论:一定剂量的NGF能促进大鼠中脑神经细胞分化和增殖,增强其活性。     

诱导性多能干细胞向神经细胞分化的研究进展

诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS cell)是通过转染外源特定的基因组合来诱导成体细胞重编程为类似于胚胎干细胞的一种多潜能干细胞,iPS细胞与胚胎干细胞不仅在形态上相似,而且在功能方面几乎相同.另外,iPS细胞的诞生克服了胚胎干细胞在临床应用时涉及的移植免疫排斥与伦理道德问题,因此具有重要的临床应用价值.目前iPS在治疗中枢神经系统性疾病方面的研究已取得很大进展,包括iPS细胞向神经细胞诱导分化方法的改进、分化机理的探索以及iPS细胞分化来源神经细胞在神经系统疾病模型中治疗作用的研究等.从iPS细胞的创建及特点、iPS细胞向神经细胞分化的诱导方法及研究新进展方面予以综述.     

诱导胚胎干细胞向神经细胞分化方法的研究与探讨

胚胎干细胞(ES细胞)是一种能够在体外进行不断自我更新,并具有多种分化潜能的细胞。胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的研究进展迅速,相关实验技术和理论也不断发展。总结了近年来各国研究者诱导小鼠和人胚胎干细胞向神经细胞分化的方法,分析了一些方法的原理并初步探讨其相关的分子机制,并提出一些可行性新方法。胚胎干细胞向神经细胞诱导分化因其体外的可操作性、来源的广泛性及质量可控性将有可能成为临床上治疗神经系统疾病的有效方法。     

敲除Pofut1不影响胚胎干细胞向神经元分化

蛋白O-连接岩藻糖基转移酶1 (Pofut1)基因缺失可导致Notch分子无法与配体结合并启动信号传递. 为研究Pofut1基因对哺乳动物胚胎干细胞（ESC）向神经分化的影响,利用Pofut1基因敲除的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞,经体外培养诱导拟胚体（EB）分化为神经细胞,计数分化为神经细胞的比例,采用细胞免疫组化染色和real-time PCR等方法,分析神经细胞特异性标志分子的表达. 结果显示,Pofut1基因缺失后,对EBC生长没有明显影响,分化过程中形成的拟胚体数量明显增多,分化的神经样细胞以及神经标志物分子的表达也明显多于对照组;Notch信号缺失对小鼠胚胎干细胞生长无明显影响,但可以促进ES细胞向神经细胞分化.     

一种获取精确胚胎天数鼠脑皮质神经细胞原代培养方法

目的:探讨获取精确胚胎天数鼠脑皮质神经细胞原代培养方法.方法:首先将性成熟雌雄SD大鼠1∶1合笼于代谢饲养盒内,次日观察有无阴栓(同时做阴道涂片),若有记为E0.取E17孕鼠断颈处死,无菌状态下取出子宫,剥离羊膜与胚外膜,取得胚胎.胚胎断头,在解剖显微镜下用尖镊沿双眼、小脑和脑干腹侧切取大脑皮质,用0.125％胰酶进行温和消化,采用MEM加10％胎牛血清、10％马血清和1％ L-Glutamine混合培养基,用0.73 MPoly-L-Omithine Hydrobromide处理的培养板入37℃,10％CO2孵箱内培养.结果:雌鼠一次可排出阴栓3-5个不等,阴栓为奶黄色、锥体形、质韧.同时做阴道涂片可见活动精子;获取得胚胎脑皮质细胞呈贴壁生长,其胞体饱满,折光性好,突起明显,与周围细胞形成网络连接.结论:用阴栓并精子涂片判断胚胎胎龄简便而准确;E17胚胎适宜体外培养获得脑皮质细胞;组合培养基加处理过的培养板和10％ CO2孵箱浓度的新方法获得了状态良好的脑皮质神经细胞.     

哺乳动物胚胎神经细胞的原代分离性单层培养及其应用

本文综合介绍了哺乳动物胚胎神经细胞的体外原代分离性单层培养(primary dissociated monolayer cultures,简称原代单层细胞培养)的特点与方法及其在体外正常形态、生化与生理等方面的分化发育。对近年来国内外神经及小儿神经科学研究中关于这种培养方法的应用情况也进行了概述并指出其优点及实用中存在的问题。     

猕猴早期胚胎脑的发育与凋亡相关蛋白P53的表达

目的探讨猕猴早期胚胎脑的发育及细胞凋亡相关蛋白P53的表达.方法建立猕猴早孕模型,获取早期胚胎,采用单克隆抗体链霉素亲生物蛋白过氧化酶 (SP)免疫组织化学方法,检测P53蛋白的表达.结果在猕猴25d、40d和55d胚胎脑均检测到P53免疫反应阳性神经细胞,随着胎龄的增加,P53免疫反应阳性表达率逐渐增大.结论在早期猕猴胚胎脑发育的不同时期内P53蛋白均有表达,并在胚胎脑发育过程中表达逐渐增加,调控脑的发育.     

人参皂甙Rb3对大鼠海马神经细胞谷氨酸损伤作用及相关机制的研究

目的：利用原代培养的海马神经细胞,研究人参皂甙Rb3对谷氨酸兴奋性神经毒性的保护作用及有关机制。方法：采用原代培养的胚胎大鼠海马神经细胞谷氨酸毒性模型,观察人参皂甙Rb3对神经细胞形态、神经细胞活性、细胞外液中乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH）的漏出率及总一氧化氮合酶（nitrogen oxide synthase,NOS）、结构型N0s、诱导型NOS活性等的影响。结果：人参皂甙Rb3对神经细胞的谷氨酸毒性损伤具有保护作用。使细胞形态保持完整,活力增加,细胞膜损伤减轻;而且人参皂甙Rb3能增加神经细胞的结构型NOS活性。降低诱导型NOS的活性。结论：人参皂甙Rb,具有抗谷氨酸兴奋性毒性作用,其作用机制可能与降低诱导型NOS活性。增加结构型NOS的活性有关。     

aFGF对原代培养的鼠胚神经上皮细胞的影响

选用１０ｄ金黄地鼠胚胎,取神经管原代培养。通过形态学观察、ＭＴＴ自动比色定量检测、神经细胞蛋白总量测定以及ＮＳＥ免疫细胞化学方法,研究了ａＦＧＦ对神经上皮细胞发育的影响。结果发现,ａＦＧＦ可明显促进突起生长,增加神经细胞存活数,提高线粒体酶的活性,增加神经细胞蛋白总量,诱导细胞分化。上述结果表明,ａＦＧＦ具有支持原代培养的鼠胚神经上皮细胞的存活、突起生长、诱导细胞分化的作用     

山羊胚胎大脑皮层神经干细胞分离、培养与鉴定

目的 :从山羊胚胎大脑皮层中分离培养并鉴定神经干细胞。方法 :利用NBS培养和单细胞克隆技术在山羊胚胎大脑皮层中分离出具有单细胞克隆能力的细胞 ,并进行培养、传代、分化观察 ,采用免疫组化检测克隆细胞的神经巢蛋白 (Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达。结果 :从胚龄 2 4～ 30d的新鲜山羊胚胎大脑皮层中成功分离出神经干细胞 ,该细胞具有连续克隆能力 ,可传代培养 ,表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论 :山羊胚胎大脑皮层中存在具有自我更新能力和多分化潜能的神经干细胞。     

小鼠胚胎干细胞在单层粘附培养中向神经细胞的分化

目的 :探讨小鼠胚胎干 (ES)细胞在无血清培养基中以单层粘附培养方式向神经分化的方法。方法 :比较ES细胞在不同培养基中的生长情况 ,分析ES细胞在不同时间分化形成神经细胞的比例。结果 :( 1 )DMEM F1 2和Neurobasal B2 7的 1∶1混合培养基最适合ES的生长。 ( 2 )单层粘附的ES细胞表达神经细胞粘附分子 (NCAM)的比例随时间增长而增加 ,而nestin的表达先增加后下降。 ( 3)ES细胞可在两周分化为神经胶质及神经元 ,形成神经网络。结论 :小鼠ES细胞可在单层粘附培养中获得向神经的高效分化。     

胚胎干细胞体外诱导分化

胚胎干细胞能在体外长期不断自我更新,具有高度分化潜能,可分化成胎儿和成体的几乎所有类型的细胞,如心肌细胞、神经细胞、上皮细胞、肝细胞、血细胞、胰岛细胞、脂肪细胞及生殖细胞等.在细胞治疗和组织器官替代治疗、发育生物学等的研究中将具有广阔的应用前景.目前已有多种胚胎干细胞体外定向诱导的报道.本文从体外诱导分化影响因素和几种主要诱导细胞类型进行分析和总结,为胚胎干细胞的诱导分化研究提供参考资料.     

胚胎干细胞体外分化为多巴胺能神经元

近年来,胚胎干细胞在体外分化为多巴胺能神经元方面取得了重大突破,这对神经发生的基础性研究和神经细胞移植具有重要意义。现对胚胎干细胞体外定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法、相关细胞因子及检测鉴定等方面进行了分析和比较,并探讨了当前存在的问题和今后发展的方向。     

干细胞生物药物研究进展

胚胎干细胞和成年干细胞经培养能产生更多干细胞也可定向分化成神经细胞、血细胞、肝细胞等特定类型的细胞。其中具有潜能的细胞可用来研究治疗帕金森病、糖尿病和脊髓损伤等疾病的生物药物。     

长链非编码RNA与细胞多向分化

本文重点概述LncRNA参与细胞分化的相关机制,列举了LncRNA在不同细胞系中参与调控的各种作用方式,如LncRNA参与维持胚胎干细胞多潜能状态、胚胎干细胞分化、神经细胞分化、肌肉分化、表皮细胞分化、成骨细胞分化、脂肪生成的机制等.     

大鼠E12.5胰腺间质细胞原代培养及鉴定

目的:体外分离培养大鼠胚胎胰腺间质细胞(pancreas mesenchymal cells).方法:以孕12.5天(E12.5)的大鼠胚胎为组织来源,通过显微分离得到E12.5的胚胎胰腺,在鼠尾胶原包覆的六孔板内进行组织块培养,观察培养过程中胰芽的形态变化,间质细胞的长出,并用细胞免疫荧光的方法对间质细胞进行了鉴定.结果:显微分离得到了胚胎胰腺,为间质细胞群包绕着上皮细胞团的结构,培养第二天即发现间质细胞的长出,培养第四天时得到间质细胞群,免疫荧光鉴定为vimentin 阳性的间质细胞.结论:本方法通过大鼠E12.5胚胎胰腺显微分离.体外培养出原代胚胎胰腺间质细胞,为进一步研究大鼠胰腺间质细胞的功能提供实验平台.     

昆明小鼠胚胎成纤维细胞的分离与培养

目的:建立稳定高效的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系.方法:取不同胎龄的小鼠分离原代胚胎成纤维细胞,观察不同胎龄小鼠对分离和培养效果的影响.结果:从不同胎龄小鼠均分离得到胚胎成纤维细胞,但最佳分离时间为13.5～14.5 d;传代时在室温下消化单层贴壁细胞可随时控制消化时间,效果良好.结论:从13.5～15.5 d胎龄小鼠胚胎分离培养胚胎成纤维细胞效果最佳.     

p35^Nch5a基因重复性找靶载体的构建和ES细胞基因打靶研究

为了在小鼠胚胎干细胞（ES）中引起神经细胞cdc2类激酶调节亚基p35