华根霉产脂肪酶发酵培养基的研究

我对摇瓶培养基存在的豆饼粉含量较高,发酵过程中产生大量泡沫,放大困难的问题,在用华根霉发酵生产脂肪酶中,以豆饼粉－蛋白胨培养基为出发培养基,经优化后的培养基组成为：工业蛋白胨６％,豆饼粉２％,卵磷脂１％,葡萄糖１％,磷酸氢二 酸镁０．０５％。与优化前相比,不仅减少了发酵过程中产生的泡沫,有利于大罐发罐,而且减少了豆饼粉残留,酶活提高１０％。     

华根霉合成活性脂肪酶液态发酵菌体形态调控的研究

华根霉(CCTCC M201021)膜结合脂肪酶在非水相中具有突出的催化酯合成的能力,在生物香料、生物柴油生产等工业应用中具有良好的前景.与许多丝状真茵形态影响其初级及次级代谢产物的生产相类似,华根霉在液态发酵中也会形成不同的茵体形态,显著影响合成活性膜结合脂肪酶的发酵水平.本研究以华根霉菌体形态及脂肪酶合成活性为指标...     

华根霉胞内脂肪酶同功酶酶学性质研究

华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)细胞破碎液经硫酸铵分级盐析、Phenyl-Sepharose FF疏水层析、DEAE-Sepharose FF离子交换层析和Sephadex G100凝胶层析得到两种脂肪酶同功酶:Lip1和Lip2。SDS-PAGE显示其亚基分子量分别为59.2kD和39.4kD。Lip1和Lip2的最适反应pH和最适反应温度相近,分别为8.0、8.5和40℃、35℃。但底物专一性差异明显:Lip1对pNP脂肪酸酯的长链脂肪酸有较高的专一性,Lip2对pNP脂肪酸酯的短链脂肪酸专一性较好;Lip1对三油酸甘油酯表现1,3-位置特异性,而Lip2没有位置选择性。1mmol/L的Ca2 、Mg2 对Lip1、Lip2有较好的激活作用;SDS强烈抑制酶活力。Lip1、Lip2在环己烷、正己烷、正庚烷和异辛烷(30%V/V)中稳定性良好。     

理性设计二硫键提高华根霉脂肪酶热稳定性

【背景】华根霉脂肪酶的工业应用前景广泛,但是受到酶热稳定性较差的限制。【目的】对华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶r27RCL分子结构进行理性设计,以提高该酶热稳定性。【方法】以Disulfide by design软件筛选r27RCL分子表面能够形成二硫键的突变位点,共得到7对二硫键突变。利用全质粒PCR进行定点突变,并在毕赤酵母中表达获得突变酶。【结果】最佳突变酶m9/10 (S85C-Q145C)与野生型酶r27RCL相比,60°C下的半衰期分别提高了4.5倍,T_m值提高了4.2°C,而催化活性保持不变。蛋白质晶体结构模拟显示,位于β2折叠上的85C和位于α4螺旋上的145C可形成二硫键,从而提高酶的热稳定性。【结论】酶分子中引入新增二硫键可以显著提升酶的热稳定性。     

易错PCR提高华根霉脂肪酶的热稳定性

为了提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的热稳定性,运用定向进化-易错PCR的方法,经两轮易错PCR引入突变,利用fast-blue RR顶层琼脂法对突变文库进行筛选,第一轮易错PCR后筛选到2株突变菌株,第二轮筛选到4株突变株。第二轮最佳突变株Ep2-4,其中3个氨基酸发生了突变：A129S、P168L和V329A。该突变酶ep2-4在60 ℃下半衰期相对原始酶r27RCL提高5.4倍,T50值提高7.8 ℃。酶学性质研究表明,突变酶ep2-4在热稳定性提高的基础上,仍保有良好的催化活性。蛋白质三维结构模拟显示,突变A129S可以和Gln133形成氢键,增加了酶表面的亲水性和极性;P168L可以与邻近的Leu164形成疏水键,导致突变酶的热稳定性提高。     

华根霉脂肪酶在黑曲霉中的重组表达研究

将华根霉脂肪酶基因RCL在黑曲霉中进行了重组表达。通过PCR技术分别获得黑曲霉Pgpd启动子和RCL-Ttrp C融合片段并克隆至质粒p CHAMBIA230,构建出RCL超表达载体p CHAMBIA2302∷Pgpd-RCL-Ttrp C。将该载体通过冻融法转化农杆菌EHA105,进而通过农杆菌介导转化法转化黑曲霉,随机挑选7株转化子,进行PCR和Southern杂交鉴定,均为阳性。对这7株转化子进行发酵和脂肪酶活力测定,结果显示,所有转化子均能表达RCL,其中T6转化子的脂肪酶活力最高,达到71 U/m L。SDS-PAGE分析表明,重组表达的RCL的分子量约为37 k D。     

华根霉产纤溶酶液体发酵条件的研究

研究了华根霉TCCC 41014产纤溶酶液态发酵的工艺条件,采用单因素实验对液态发酵培养基的碳源、氮源、初始pH值、温度和装液量进行了优化.结果表明,实验范围内华根霉TCCC41014液态发酵产纤溶酶的适宜培养基组成(g桙L):糊精80,蛋白胨60,豆粕60,初始pH为4.5.适宜培养条件:培养温度为29℃,装液量为5...     

固液态发酵中橄榄油对Rhizopus chinensis全细胞脂肪酶的影响

主要对华根霉全细胞脂肪酶固态和液态两种发酵过程进行比较,并着重探讨不同培养方式下橄榄油对其合成活力和水解活力的影响。结果表明：液态培养较有利于菌体生长,对脂肪酶的生产也有一定的促进作用。橄榄油的加入不仅有利于菌体生长、提高脂肪酶水解活力,更可使脂肪酶的合成活力显著增加,液态发酵下的效果更为明显。橄榄油在整个发酵过程中可能既作为碳源又是脂肪酶的诱导物。另外,全细胞脂肪酶的水解活力和合成活力在固液态发酵条件下均存在不对应性,表明华根霉可能产性质不同的脂肪酶同功酶。     

华根霉前导肽和成熟肽脂肪酶基因的克隆表达及性质研究

以华根霉(Rhizopus chinensis CCTCCM201021)为出发菌株,提取总DNA,PCR扩增出前导肽脂肪酶基因(proRCL)及成熟肽脂肪酶基因(mRCL),克隆到原核载体pET-28a,转化E-coli BL21(DE3),诱导表达并纯化出活性目的蛋白.经SDS-PAGE分析,重组蛋白ProRCL和MRCL的分子量分别约43 kD和33 kD.两重组脂肪酶主要酶学性质基本相似,最适反应温度均为35℃,40℃下较为稳定;最适反应pH相近,分别为8.0和8.5;以pNP脂肪酸酯为底物,均对短链脂肪酸酯底物特异性较高.MPCL上述性质与野生型RCL基本一致.研究结果表明,通过条件控制可以利用E.coli表达系统表达具有活性的华根霉前导肽脂肪酶ProRCL和成熟肽脂肪酶MRCL.与米根霉脂肪酶(ROL)不同,前导序列对华根霉脂肪酶的主要酶学特性没有显著影响.     

定向进化-易错PCR方法提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力

运用定向进化-易错PCR的方法,提高了华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的活力。经过两轮易错PCR和pNPP顶层琼脂法筛选,从第一轮和第二轮突变库中分别筛选获得最佳突变株1-11和2-28,脂肪酶酶活与野生菌株相比分别提高2倍和4倍。基因比对结果表明,突变脂肪酶2-28有4个氨基酸发生了突变:A129S、K161R、A230T、K322R。蛋白质分子空间结构模拟显示,突变A129S、K161R、A230T位于脂肪酶分子表面。突变A230T增强了α-螺旋盖结构的稳定性。突变K322R处在loop上,靠近脂肪酶底物结合区域,与邻近的Asp(带负电)形成盐桥。静电引力将该loop向底物进入酶活性中心的通道口反方向牵引,使底物分子更易进入酶活性中心。酶学性质研究表明,突变株2-28脂肪酶的Km值比出发菌株下降了10%,Kcat值提高为原来的2.75倍。     

华根霉液态培养生产脂肪酶不同形态菌体的转录组差异分析

【背景】作为发酵工业中一类重要的生产菌株,丝状真菌目的产物的形成与菌体形态有着紧密的联系。华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021是从我国传统酿造浓香型白酒大曲中筛选到的一株丝状真菌,其生成的包括脂肪酶在内的酶蛋白具有较高的工业应用价值。【目的】华根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC M201021在脂肪酶液态发酵中形成两种不同形态菌体,发酵表现差异明显。本研究考察华根霉不同菌体形态及其细胞代谢在转录组水平的内在差异。【方法】基于RNA-Seq高通量转录组测序,分别对液态培养获得的不同形态华根霉菌体高表达和显著差异表达的转录基因进行功能分析。【结果】两种形态菌体转录组存在明显的差异。利用RPKM值对表达量最高的前20个基因进行分析,聚集态菌体高表达基因主要为不同类别的核糖体蛋白,而分散态菌体中与细胞形态相关的几丁质酶及与信号传导相关的基因也是高表达基因。在两种形态菌体显著差异表达的20个基因中,除了涉及代谢的基因有明显不同外,分散态菌体中也有一些涉及"细胞过程与信号"的基因上调表达显著。两种形态菌体中独有表达基因总体表达量均较低,但聚集态菌体独有表达基因在基因种类和表达量上都要明显高于分散态菌体。同时,转录分析表明,华根霉脂肪酶在聚集菌体中较高的生产水平与脂肪酶基因的高水平转录有关。【结论】菌体形态的差异显著影响了华根霉的转录组,不仅不同形态菌体高表达基因和显著差异表达基因有明显不同,而且功能相同的蛋白在不同菌体形态下也多是由不同基因表达,它们可能承担着不同的作用。总体而言,华根霉聚集态菌体中存在更为复杂的生理过程,而分散菌体中受到信号的传导和调控似乎更多。菌体形态的改变可能是细胞分化的结果,伴随着菌体对细胞微环境改变的一种响应。研究结果为深入了解丝状真菌形态分化的内在机制及其影响提供了一些线索。     

D190V点突变提高华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶的最适温度和热稳定性

【目的】对来源于Rhizopus chinensis CCTCC M201021的脂肪酶进行了D190V定点突变, 提高该酶的最适温度和热稳定性。【方法】对毕赤酵母表达的突变酶D190V与野生型酶r27RCL进行酶学性质比较。【结果】D190V的最适温度比r27RCL高5 °C, 65 °C下的半衰期提高了一倍, 在其他性质方面, 突变酶D190V与r27RCL基本相似。【结论】通过结构分析表明, 定点突变D190V提高该酶稳定性的主要原因可能在于提高了突变位点所在的α螺旋的稳定性以及增强了稳定蛋白质结构的氢键作用力。     

壳聚糖固定化德氏根霉脂肪酶的研究

研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对脂肪酶固定化条件,在室温条件下将0．4g酶粉溶于pH6．0缓冲液中,加入10g壳聚糖,摇匀,再加入浓度为0．6％戊二醛交联6h,得到固定化酶,酶活力回收率约为54．2％。固定化酶的半失活温度比游离酶的高,半失活温度由游离酶的47℃提高到100℃,最适反应温度由40℃上升至80℃,最适pH由6下降到5．5,固定化酶K’m值由游离酶的Km 50mg／mL增加到56mg／mL。该固定化脂肪酶用于酯的合成;在80℃条件下经过10批次连续水解植物油反应,固定化酶的活力仍保持在82．6％以上。     

诱导温度调控华根霉(Rhizopus chinensis)前导肽脂肪酶的表达及稳定性研究

比较了7 L发酵罐中不同诱导温度对华根霉前导肽脂肪酶在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达水平和稳定性的影响。通过实验表明在28℃条件下,最大酶活可以达到1412.5 U/mL,是30℃条件下的2.3倍,25℃条件下的1.3倍;而其产率可以达到12811 U/L·h~(-1),比产率达到82.6 U/g_(DCW)·h~(-1)。同时,在实验过程中发现诱导温度对目的蛋白的降解和聚合有重要的影响。通过对蛋白酶活性的测定和还原SDS-PAGE证实随着诱导温度的提高,蛋白酶活性急剧上升,从而导致由前导肽(37 kD)降解为成熟肽(30 kD)的降解作用的加剧。此现象在30℃条件下最为明显,在诱导84 h时前导肽已经全部降解为成熟肽。另外,通过非还原SDS-PAGE和分析表明随着诱导温度的提高也导致了二聚体的含量也逐渐增加。