感染病毒的侧耳的超微结构

从侧耳属的两个种——糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)和(Pleurotus sp.)中,提取到一种直径为23rim的球形病毒颗粒。在糙皮侧耳子实体细胞的超薄切片中病毒直径为21nm,病毒颗粒团状紧密或松散的聚集或以分散的形式存在于胞质内,常常被以膜结构。并提供了病毒在菌丝内通过隔膜孔器桶孔(dolipore septum)进行胞间易位的证据． 隔膜器的桶孔径是属于小孔径类型。本文是侧耳属病毒的首次报道。     

甘薯羽状斑驳病毒分离提纯及血清学特性

从感染有甘薯羽状驳病毒的牵牛（I．Nil）叶片,通过超速离心,Cscl密度梯度离心提纯SPFMV粒子,每千克叶片可得病毒13－15毫克。电镜观察病毒粒子长度范围在820－860nm,也可见到900nm以上的特长粒子。病毒提纯物的紫外吸收曲线呈典型核蛋白吸收曲线,OD260／OD280＝1．21,免疫电镜检查,该病毒与SPFMV抗血清起阳性反应。     

黑曲霉T21 glaA 5′上游调控区DNA与蛋白因子的相互作用分析

以糖化酶生产菌株黑曲霉T21(Aspergillus niger T21)的糖化酶基因(glaA)5′cis调控区片段为探针, 采用电泳迁移率变动分析(EMSA)法,从黑曲霉蛋白粗提液中检测到与glaA 5′调控区特异结合的蛋白因子,并把其结合DNA定位在T21 glaA 5′调控区的-374~ -344,-484~-414以及-580~-540 bp 3个区段, 且此3个结合DNA的片段在EMSA实验中呈现交叉竞争, 表明这3个DNA区段可与同一个蛋白因子相结合. 以-374~-344 bp序列为探针的紫外交联实验表明, 该蛋白因子的分子量(或亚基分子量)约为10 ku. 利用DNaseⅠ足印分析确定了此蛋白因子在前两个区段的精细结合部位, 并对其结合序列的特性进行了分析.     

广西云南玉米霜霉病病原菌订正

在我国文献中广西云南玉米霜霉病菌名称为Peronosclerospora maydis (Racib．)C. G.Shaw。但是我们观测病菌孢子囊为长椭球形;在13℃—28℃产孢温度范围内,随温度升高孢子囊长度增加而宽度基本不变,表明它不是P．Maydis,而是P．Sacchari (T．Miyake)Shirai ＆ K．Hara,或 P．Philippinensis (Weston)C．G．Shaw。以四种 Peronosclerospo-ra的DNA及广西云南病菌的DNA与探针pCLY83杂交的RFLP图谱进一步证实了此结果,并表明 P.sacchari 与 P．Philippinensis为同种异名。因此我国广西云南玉米霜霉菌名称应为 Peronosclerospora sacchari (T．Miyake) Shirai & K．Hara,现予订正。     

中蜂囊状幼虫病病毒的三维结构

提取纯化中蜂囊状幼虫病病毒(CSBV)的RNA,通过RT-PCR扩增获得1069bp的DNA片段,将其克隆到pGEM-T Easy载体上.测序分析表明,该段基因序列与意蜂囊状幼虫病病毒(SBV)基因序列的同源性为87.6%,与之对应的氨基酸序列的一致性高达94.6%,说明CSBV是与SBV十分相似而又不相同的病毒.在此基础上,应用冷冻电子显微镜与计算机三维重构方法测得病毒颗粒的三维结构,分辨率为2.5nm,其衣壳按T=1(p=3)的对称二十面体结构排列,表面光滑,有12个五邻体和132个孔洞.研究还发现,病毒内部的核酸是按5-3-2对称的二十面体结构排列,这种排列方式在细小RNA病毒中尚未见报道.     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

含有拟病毒RNA的绒毛烟草斑驳病毒在克里夫兰烟原生质体内的增殖

利用酶联免疫吸附分析(ELISA)的双抗体夹心法和未标记免疫过氧化物酶法(PAP),研究了含有拟病毒RNA (Virusoid RNA)的绒毛烟草斑驳病毒(Velvet tobacco mottle virus,VTMoV)侵染克里夫兰烟(Nicotiana elevelandii A. Gray)原生质体的最适条件以及病毒在原生质体内增殖的一步生长曲线,建立了一种适宜VTMoV增殖的原生质体细胞体系。     

一种以PCR产物直接构建同源重组杆状病毒的方法

发展了一种在不构建载体的前提下, 以PCR产物直接构建同源重组杆状病毒的方法. 这种方法建立在λ噬菌体Red重组系统能介导36 bp以上的同源片段产生同源重组的基础之上. 以棉铃虫单粒包埋型核多角体病毒(HaSNPV)为例, 详细地介绍了以氯霉素抗性基因(CmR)置换HaSNPV基因组中orf135的快速重组过程. 人工合成一对长60 bp左右的引物, 其中40 bp与HaSNPV orf135的头部和尾部序列同源, 另20 bp分别为氯霉素抗性基因的尾部和头部序列. 以含有CmR的质粒pKD3为模板, 利用这对引物PCR合成两侧各有40 bp orf135同源臂的CmR基因, 将此线性片段转化含有HaSNPV人工染色体(Bacmid)且能表达λ噬菌体Red重组酶的菌株中, 获得了缺失orf135并对氯霉素具有抗性的重组转化子. 由于整个过程无需构建载体, 重组过程在大肠杆菌中完成, 使得构建同源重组杆状病毒的过程大大缩短. 这种方法将广泛适用于其他具有较大基因组的病毒的基因置换和基因缺失.     

紫云英根瘤菌共同结瘤基因nodA和nodBC的核苷酸序列

以~(32)p标记的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)2.3kb nod DNA作探针,从紫云英根瘤菌(Rhizobium huakuii即R. astragali)159基因文库中分离到一株能与探针DNA呈阳性反应的克隆pRaN109。同源DNA-DNA杂交及DNA序列分析表明:pRaN109DNA的9kb EcoRI片段上携带了nodD_1BC基因,pRaN109 NDA的18kb EcoRI片段上携带了nodD_2A基因。共同结瘤基因nodA与nodBC两者相距6.7kb。在nodA基因和nodBC基因的上游都存在有结瘤盒(nod box)。与来自不同种属的菌株所报告的结果相比较,紫云英根瘤菌159中的共同结瘤基因有着明显不同的组合。     

柑桔碎叶病毒研究

用汁液摩擦接种方法对柑桔碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)进行了进一步的生物学鉴定.结果表明,该病毒除在豇豆上引起枯斑外,还侵染克里芙兰烟(Nicotianaclevilandii)产生系统斑驳和轻花叶,侵染昆诺藜(Chenopodium quinoa)和苋色藜(C.amaranticolor)引起系统坏死和花叶,侵染鸡冠花(Celosia cristata)引起局部环斑.这些草本寄主均可作为CTLV的指示植物.在发病的柑桔叶汁液中,测得CTLV的稀释限点为10~(-5).经汁液摩擦接种,可以将CTLV从克里芙兰烟传播到木本指示植物柑桔和枳橙上.感病植物材料的组织超微结构观察结果表明:CTLV感染柑桔、枳橙、克里芙兰烟和昆诺藜均使其叶肉薄壁细胞的叶绿体出现淀粉沉积、叶绿体片层结构解体和消失;病毒在受感染的植株叶脉韧皮部细胞中紧密聚集,形成病毒结晶体;这种结构也出现在叶肉薄壁细胞中.这是关于该病毒组织病变的首次报道.用直接负染方法从感染CTLV的柑桔(枳橙)、克里芙兰烟和昆诺藜病叶中均能检查到线状病毒粒子,用改良的Deriick’s免疫电镜方法和琼脂双扩散方法测定均显示该病毒…     

棉花微管蛋白基因GhTub1在纤维细胞中的特异表达

以陆地棉(Gossypium hirsutum )纤维发育前期和中期的胚珠及纤维细胞为材料构建cDNA文库, 通过ESTs分析获得了一个β-微管蛋白家族成员(GhTub1). 以该cDNA的3′-UTR为探针, 利用Northern杂交方法, 对GhTub1基因在棉花不同器官及棉纤维不同发育阶段的表达进行了分析, 发现该基因的表达具有棉纤维细胞特异性. 在纤维发育过程中, GhTub1转录产物的累积主要发生在纤维细胞延伸阶段, 在纤维延伸速度最快时达到高峰. 利用裂殖酵母系统, 对GhTub1的细胞内功能进行了初步分析, 发现该基因在酵母中过量表达能使其细胞显著伸长或分支. 这些实验结果暗示GhTub1基因可能在纤维细胞的极性延伸中具有功能.     

牲畜链霉菌异青霉素N合成酶基因的克隆与序列分析

产生含硫卜-内酰胺类抗生素的不同微生物种属间(包括原核和真核)的异青霉素N合成酶(IPNS)基因存在着明显的同源性。利用S. lipmanii IPNS基因探针验证了牲畜链霉菌(S. cattleya)染色体DNA中确实含有与之同源的区带,通过与牲畜链霉菌无活性阻断突变株互补克隆的方法,获得了同时含有硫霉素环化酶及IPNS基因的重组质粒。经基因序列分析表明牲畜链霉菌中IPNS基因,由963bp组成,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA,共编码321个氨基酸,所克隆的牲畜链霉菌IPNS基因编码蛋白与已知的S. clavuligerus的IPNS相似性为56％,与S. lipmanii的IPNS相似性为64％。     

林可链霉菌中的同源重组

为研究链霉菌中的同源整合频率和机制 ,采用不能在链霉菌中复制的大肠杆菌质粒转化链霉菌StreptomyceslincolnensisB48。质粒pYYE0 4a1上携带的被硫链丝菌素抗性基因灭活的林可霉素生物合成基因与染色体DNA上的同源基因发生重组 ,经过低抗筛选 ,得到两个突变子S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2。进一步以硫链丝菌素抗性基因为探针杂交染色体DNASmaⅠ片段 ,S .lincolnensisYY1和S .lincolnensisYY2都得到 1 5kb的阳性条带 ;而以缺失的lacZ基因为探针杂交染色体DNAHindⅢ和SmaⅠ联合酶切片段 ,只有S .lincolnensisYY2得到 4 4kb的阳性条带。Southern杂交结果表明S .lincolnensisYY1是由同源交换或二次重组产生的 ,而S .lincolnensisYY2为同源整合的结果。为验证同源整合子上大肠杆菌复制子和氨苄抗性基因的存在 ,用SphⅠ酶切染色体DNA后连接 ,连接液转化E .coliJM83感受态细胞 ,在氨苄抗性板上得到 2个转化子 ,命名为pSLE1。对…     

利用超氧化物歧化酶免疫学研究确定东方弧菌和一些海洋细菌的关系

本文报道了应用超氧化物歧化酶(Superoxide desmutase, SOD)的免疫学研究(微量补体结合和凝歧双向扩散技术)确定东方弧菌(Vibrio orientalis)和其他一些海洋细菌间的关系的结果。以从V. ALGTNOLVTCUS 90、V. splendidus biotype II 2、V. fischeri 61、 V. cholerae M13中提取的SOD作为抗原制成的血清,和东方弧菌715、716、717菌株的SOD进行反应,测得免疫距离分别为6 4士0．1、23 5士0．2、26 0士0.8和59．2士0．4ImD。这一结果表明,东方弧菌虽属于弧菌属,但不同于弧菌属的其他种。三度空间的模型说明东方弧菌和许多海洋细菌有关,其中包括常见的V. harveyi、V. algtnolyticus、V. parahaemolyticus、V. pelagtus、V. nereis、V.camobellit.最接近的海洋弧菌为菌株77。     

口蹄疫病毒China/99基因组RNA序列测定及比较分析

测定了1999年我国口蹄疫流行毒株(China/99, Tibet)基因组全序列, China/99基因组RNA全长8173个核苷酸(nt), 开放阅读框含盖6999 nt, 编码2332个氨基酸的聚合蛋白. 5′和3′非翻译区(UTR)分别长1081和93 nt. China/99与12株参考株基因组序列比较发现: China/99与英国2001年流行毒、海南和西藏1999年流行毒1d基因的序列同源性高达97%以上, 均属泛亚毒株; 在牛和猪FMDV的功能未知区、p2和p3区存在较为显著的核苷酸序列差异, 3a基因最为显著; l, 1a, 1b, 2a, 2c, 3b和3d基因没有核苷酸缺失或插入现象, 属于病毒必需基因; 口蹄疫病毒S片段、功能未知区和内部核糖体进入位点(IRES)二级结构均可分为3种类型. S片段和3′UTR折叠成一个三叶草类似结构.     

高压导致水稻变异品系发生DNA甲基化模式及基因组结构的改变

用高压力诱变水稻品种“毕粳38”, 产生了两个稳定的变异: 变异1与变异2. 对原种及两个变异品系的基因组DNA及Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ酶切后的基因组DNA采用ISSR及RAPD分析; 并通过特异引物分析水稻的转座子mPing的变化; 且对变异片段纯化测序; 同时以水稻基因组中潜在活跃的反转录转座子LTR(long terminal repeat)Osr7, Osr36, Tos19(Osr54)以及转座子MITEs(miniature inverted-repeat transposable elements)的mPing和Pong及某些特异片段为探针, 进行Southern杂交. 结果显示原种及两个变异品系不仅存在着基因组结构的变异, 而且发生了DNA甲基化模式的改变. 此外, 对原种及两个变异品系进行了异地栽种, 其形态水平的变异稳定表达. 结果表明: 高静水压对高等植物的种子进行诱变, 产生表型变异的分子基础是由于发生了DNA分子水平上的广泛变异, 并证明高压可导致水稻多种转座元件的可能激活及DNA甲基化模式的改变. 因此可以认为高压是引起植物遗传变异一个重要因素, 可能在作物诱变育种中具有广阔的应用前景.     

烟草花叶病毒和番茄花叶病毒在含N基因烟草上的症状差异是由运动蛋白基因决定的

烟草花叶病毒(TMV)和番茄花叶病毒(ToMV)是烟草花叶病毒属中关系最为密切的病毒, 但它们在含N基因烟草上产生的枯斑大小有明显的差异. 比较了TMV, ToMV及用ToMV运动蛋白基因(MP)精确置换TMV MP后获得的重组病毒T/OMP在不同寄主上的症状差异, 发现T/OMP在含N基因烟草上产生的枯斑大小与ToMV相似. 分析比较TMV, ToMV和T/OMP外壳蛋白和MP在植物体内的积累水平, 发现三者之间没有明显的差异, 而TMV和T/OMP在原生质体中的复制水平也没有差异. 比较TMV, ToMV和T/OMP接种后烟草体内防御相关酶(PAL, POD和PPO)的活性变化, 结果T/OMP和TMV所诱导酶的变化趋势基本一致, 而与ToMV有所差异, 因此认为MP基因功能的差异决定了TMV和ToMV在N基因烟草上枯斑的大小.     

一种快速提取真菌染色体DNA的方法

介绍了一种适用于多种真菌染色体DNA的快速提取方法。该方法用石英砂振荡破壁 ,快速便捷地提取真菌染色体DNA ,提取时间仅用 1～ 2h。作者应用该方法成功地提取了粗糙脉胞菌 (Neurosporacrassa)、米曲霉 (Aspergillusoryzae)、羊肚菌 (Morchellaesculcnta)、酿酒酵母 (Saccharomycescervisae)等 4种不同真菌的染色体DNA ,所提DNA片段均大于2 0kb ,可直接用于限制性内     

苏云金芽孢杆菌以色列亚种130kd杀蚊蛋白基因的克隆与鉴定

以人工合成的130kd杀虫蛋白基因的18—base序列为探针,通过SoutherD分子杂交,验证了在Bacillus thuringiensis var.israelensis 4Q5菌株75Md质粒上含有130kd杀蚊蛋白基因,并且证明了提纯的晶体蛋白具有杀蚊幼虫活性。对该质粒进行HindIII完全酶切,以pUCl8为载体,以E．Coli TG1为受体,得到四个与探针有强杂交信号的阳性克隆,其中两个(pFH2,PFH4)含有5．2kb HindIII插入片段,包含第一类130kd杀蚊蛋白基因;另两个(pFHI,pFH3)含有2．3kb HindIII插入片段,包含第二类13 0kd杀蚊蛋白基因的3'部分。pFH2和pFH4中,第一类130kd杀蚊基因的插入方位不同。