一种有效纯化低拷贝质粒DNA的改良硅藻土法

碱法制备的低拷贝质粒因含有大量杂质而无法获得有效的测序结果。为此,以纯λDNA为样品,对硅藻土纯化DNA的方法进行了优化,表明硅藻土悬液的最佳用量是20μl／μgλDNA,回收率达77．31％。应用此改良硅藻土法纯化一长为14953bp的低拷贝质粒pLZ14,所得质粒纯度达23．87％,比未纯化前提高了11．06倍。经纯化的pLZ14质粒测序信号强、无误认碱基,而未经纯化的质粒测序时信号弱、错误普遍存在。     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

920805通过酚抽提法从服硫氛酸中纯化质粒〔英〕/Fishe-r,J .A.…了Anal.Bioehem一1991,194(2)一309~315【译自DBA,1991,10(15),91-08441〕 该方法利用自动核营酸提取设备。基本操作是于pH4.5时用酚从IM的脏氰酸中进行抽提,这样能从水相中有效地去除染色体DNA,而超螺旋的质粒DNA仍留在水相中。51核酸酶消化表明,去除的染色体DNA已经变性,因而可溶于有机相。整套方法包括:用溶菌酶、RNA酶A和蛋白酶K连续预处理细菌细胞;消化后的溶液用酚/氯仿十水混合物抽提二次,再用氯仿抽提一次。通过异丙醇沉淀收集纯化的质粒。这样提纯的质粒中…     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

931129由各种方法纯化的质粒ONA的Taq循环翻序〔英〕/Hradetzky,D.…1 Bioteeh Forum Eur一1092,9(7~8)一471~472〔译自DBA,1992,11(20),92一11144) DNA模板的纯化是测序中最关键最困难的一步。就DNA得率、花费、碱基范围和碱墓精确率等方面,考察了制备双链DNA的各种方法,包括小型制备一水煮法,小型制备一碱法,氮化艳制备法,Stratagene过柱法,Qiagen过柱法。采用质粒pBlueseript IIKS、ABI Taq引物循环侧序药盒及AIB Taq染料脱氧终止子循环测序药盒,对DNA进行自动测序。Stratagene或Q二age。层析给出高纯度DNA,使测序范围…     

CTAB选择性沉淀和纯化质粒DNA工艺的建立

通过直接在大肠杆菌碱裂解上清中加入十六烷基三甲基溴化铵(CTAB), 优化CTAB与质粒DNA量的比例、质粒DNA选择性释放溶液的选择和TritonX-114的使用, 建立了简单、易行的大规模质粒DNA纯化工艺。纯化质粒DNA的质量检测结果显示, CTAB纯化的质粒DNA无菌体RNA污染, 菌体基因组DNA、内毒素和蛋白含量分别小于 100 ng/mg、50 EU/mg和10 mg/mg质粒DNA, OD260/OD280比值介于1.75~1.85之间, 超螺旋质粒DNA的比例大于80%, 该工艺纯化的质粒DNA能达到或接近FDA规定的人用质粒DNA的各项指标, 整个过程不使用动物源性酶和苯酚、氯仿、无水乙醇等有毒或易燃、易爆试剂, 成本低廉, 工艺环保。     

快速检查寡聚DNA片段序列的方法

以质粒为模板,用待测寡聚DNA片段和通用测序引物进行PCR（聚合酶链式反应）,PCR片段经纯化后插入到pUC－18或pUC－19的多克隆位点中,然后用通用测序引物测定重组质粒上待测寡聚DNA片段,即可清晰、正确地知道它的序列．     

家蝇Thymosin(THY)基因的克隆及原核表达

采用EST测序技术从构建的家蝇(Musca domestica)幼虫c DNA质粒文库中筛选到胸腺肽(Thymosin,THY)基因,以该基因的c DNA文库质粒为模板,设计引物,通过PCR扩增,测序鉴定,获得THY基因完整编码序列。运用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白的基本理化性质、信号肽和亚细胞定位等方面进行预测和分析。构建p ET-28a(+)-THY重组质粒,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。研究结果表明,THY基因ORF全长384 bp,编码127个氨基酸,理论分子量14.3 k D,等电点为5.22,具有THY家族的蛋白保守结构域。构建重组原核质粒p ET-28a(+)-THY,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得表达,经亲和层析柱纯化获得目的蛋白,Western blot检测发现纯化的目的蛋白大小正确。     

苏云金芽孢杆菌大型质粒DNA的小量提取

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种、猝倒亚种及以色列亚种为材料,介绍了低拷贝大型质粒DNA的小量提取方法,该法采用PEG 6000进行质粒纯化,省略了苯酚和氯仿抽提过程。实验证明,该法结果稳定,提取的质粒DNA产量和质量均符合大多数分子生物学实验的要求。     

双磁珠法质粒DNA提取技术及应用

质粒是基因合成与测序领域中使用最为频繁的基因运载工具,然而传统的质粒DNA提取方法面临提取通量低、生产成本高等问题,无法满足日益增长的需求。本研究基于质粒提取原理,开发了双磁珠法(double-magnetic-bead method, DMBM)质粒提取技术,探究了磁珠投入量、质粒DNA片段大小、菌液投入量等因素对质粒提取的影响,并且对比了本技术与商业化质粒DNA提取试剂盒提取DNA质量、提取通量及提取成本。结果表明,双磁珠法质粒DNA提取技术可满足不同细胞密度、不同片段长度的质粒DNA提取。此外,该技术搭载96通道全自动核酸提取仪,提取的质粒DNA纯度更高、提取时间缩短80%、提取成本缩减57.1%,从而实现了质粒DNA提取的高通量、低成本,有效助力基因合成与测序。     

自动测序仪的发明者--记科学家胡德

DNA自动测序仪的发明实现了DNA测序的自动化,从而大大促进了基因测序的进程．对于人类基因组计划的实施具有极大的推动作用,今天DNA自动测序仪G成为分子生物学研究中不可缺少的仪器,对于生命科学的蓬勃发展做出了巨大贡献。简要介绍自动测序仪的发明者胡德教授的生平,了解这位科学家的贡献和测序仪的发明过程。     

核酸及蛋白质合成、提取、纯化

930378质粒DNA的■促纯化[英]/Isfort,R.J./BioTechniques.一1992,12(6).一798---804[译自DBA,1992,11(15),92-08366] 本操作只需2小时,不用昂贵设备,花钱少。如此提纯的质粒DNA可用于限制性酶切,.克隆、亚克隆、定序、缺口平移分析和末端标记。用此法纯化的质粒为MSVcL,它含有野生型p53肿瘤抑制子基因。培养携该质粒的大肠杆菌,细胞用碱裂解处理后离心,再用酚·氯纺(1 t 1)和异丙醇处理细胞团。离心后将细胞困重悬于50raM Tris—HC。l’(pH8,含30mM MgCII、O.5raM ATP和10m。|yI磕基乙醇,总体积1 m1)。加20/,I酶液(含100U R…     

GST—talinl融合蛋白的原核表达及纯化

应用PCR方法扩增talinl的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX-4T-1中,获取人源的GST—talinl融合蛋白,为下阶段深入的研究talinl的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础。经酶切、序列鉴定．选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B柱纯化,western blot鉴定。克隆得到了一个2400bp的talinl的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为121、6kD的融合蛋白。用基因工程方法使GST—talinl重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST—talinl融合蛋白。     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA表达载体的构建及鉴定

目的：构建特异性抑制甲胎蛋白（AFP）的小干扰RNA（siRNA）表达载体,为进一步研究AFP基因功能及AFP相关肿瘤的基因治疗奠定基础。方法：设计并合成AFP特异性的短链寡核苷酸,退火形成双链DNA片段,通过与RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express Donor Vector连接、转化大肠杆菌、扩增、纯化得到所需质粒,用琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。结果：琼脂糖凝胶电泳证实纯化后的质粒大小约为6740bp,测序证实插入序列与合成的寡核苷酸序列完全符合。结论：构建了AFP特异性的siRNA表达质粒pSIREN-DNR—DsRed-Express Donor Vector-AFP。     

基因测序软件

美国Intelligenetics公司出版了一本描述其测序产品方法的新手册。该手册叙述了自动译读DNA测序放射自显影照片的仪器设备,在Macintosh、PC、Sun和VAX计算机上进行DNA和蛋白序列分析的软件、联机服务、专门数据库、技术援助服务以及数据库检索程序。联系地址:Kate Hutchinson,Marketing Communications Manager.Intelligenetics Inc.,700 East E1     

GST-talin1融合蛋白的原核表达及纯化

应用PCR方法扩增talin1的cDNA,并将其重组入谷胱甘肽转硫酶融合基因表达载体pGEX-4T-1中,获取人源的GST-talin1融合蛋白,为下阶段深入的研究talin1的结构、功能、及其与之相互作用的蛋白打下基础.经酶切、序列鉴定,选择正确重组子,将其质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,用Glutathione Sepharose 4B柱纯化,western blot鉴定.克隆得到了一个2400bp的talin1的cDNA片断,重组质粒目的DNA测序正确,纯化出分子量约为121.6kD的融合蛋白.用基因工程方法使GST-talin1重组质粒在原核细胞表达并成功纯化出GST-talin1融合蛋白.     

基于模板转换的微量RNA测序建库方案探索

目的:建立一套简便、对RNA样本起始量要求很低的RNA测序建库方法,在此基础上引入分子条形码技术,从而使RNA-seq的数据所反映的表达丰度更加客观真实。方法:将微量RNA用RNaseⅢ片段化后,利用反转录酶的反转录活性、模板转换活性以及DNA依赖的DNA聚合酶活性,一步实现从RNA到cDNA文库的反应,再通过PCR扩增获得适合测序仪的测序文库,通过测序分析验证建库效果,最后采用荧光定量PCR法测定部分基因的表达量以验证测序结果,同时比较分子条形码的引入对表达量分析的影响。结果:通过电泳观察和测序结果分析,选择Clontech公司的SMARTscribe,反转录和模板转换反应温度设为50℃,反转录完成后经AMPure Beads纯化再经PCR扩增得到测序文库,电泳检测文库DNA长度和浓度符合测序要求。比较发现,用分子条形码建库的测序结果能够更加真实地反应基因的实际表达量。结论:初步建立了针对10 ng RNA样品的RNA-seq建库技术,并在建库方案中加入分子条形码使其测序结果更加真实地反映基因表达量。该技术未来可适用于微量RNA样品的高通量测序。     

用琼脂糖凝胶制备电泳——冻融法纯化质粒DNA

随着基因工程研究的不断发展,DNA做为一种实验材料要求纯化方法更加简便,质量更高。目前关于质粒DNA的纯化方法已有许多报道。国外多采用氯化铯密度梯度离心法,国内则限于条件,很少应用此法。我们建立了琼脂糖制备电泳——冻融法,以纯化质粒DNA及DNA的酶切片段。方法简便易行,而且效果良好。     

PTD-BDNF融合基因克隆、表达和纯化

构建含蛋白转导结构域(PTD)与脑源性神经营养因子(BDNF)融合基因的质粒,并在大肠肝菌中表达。用PCR扩增PTD-BDNF融合基因,经DNA测序无误后插入表达质粒pJW2构建质粒pJPB,转化大肠杆菌并进行PTD-BDNF蛋白的诱导表达和纯化。结果DNA序列分析表明构建含有PTD-BDTF融合基因的质粒与设计相同,PTD-BDNF融合蛋白在大肠杆菌中获得表达并进一步纯化。     

一种大规模筛选单克隆及提取质粒的改进方法

利用α-互补(X-gal IPTG)从cDNA库中筛选特异克隆,以此去除含有未插入片段和插入片段小的克隆。运用展库的方法,通过辅助噬菌体对库中多个载体的切割,将载体以质粒的形式转化到大肠杆菌中;同时对质粒DNA碱裂解提取方法做了改进,建立了一种简单实用的大量提取质粒DNA的方法。该方法利用特定的蛋白质吸附膜吸附提取过程中的蛋白质,从而去除了使用酚-氯仿抽提蛋白质的复杂过程,减少了质粒DNA的损失,是一次性获得大规模质粒DNA的有效方法。获取的质粒DNA样品在纯度和浓度上都可以满足测序、PCR及Southern杂交等分子生物学实验的要求。     

人抗酶抑制因子-1的克隆与原核表达

目的:克隆人抗酶抑制因子-1(ornithine decarboxylase antizyme inhibitor-1,OAZI-1)cDNA,建立在大肠杆菌中原核表达并纯化人OAZI-1蛋白的实验技术。方法:巢式RT-PCR法从人A549总RNA中扩增人OAZI-1 cDNA并构建pET-28a/OAZI-1原核表达质粒。该质粒转化大肠杆菌原核表达菌BL21(DE3)后IPTG诱导表达。诱导表达出的重组蛋白用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。SDS-PAGE和Western法检测重组OAZI-1蛋白的表达和纯化。结果:成功克隆出编码全长人OAZI-1的cDNA序列,并构建出原核表达质粒pET-28a/OAZI-1。DNA测序分析,重组质粒中的OAZI-1 cDNA无突变,与6×His标签框架对接正确。重组质粒转化入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中后,可用IPTG诱导表达出重组OAZI-1蛋白,该重组蛋白可用Ni-NTA树脂亲和层析纯化。结论:成功建立了人抗酶抑制因子的原核表达和纯化的实验方法,为后续OAZI-1的功能研究奠定了基础。     

人地中海贫血β654基因作为外源基因用于转基因的制备方法

目的探讨人地中海贫血β654基因为外源基因用于转基因小鼠制作时,外源基因的制备方法,为进一步制作转基因小鼠打下基础。方法采用反向点杂交法确诊人地中海贫血β654纯合子DNA,以PCR法扩增获得人地中海贫血β654基因,分离纯化后,通过连接酶反应将其克隆入含βLCR调控序列的基础载体pBGT51质粒中,经PCR扩增、酶切、反向点杂交及DNA测序鉴定重组质粒,用EcoRⅤ酶切获得转基因所用的外源基因。结果将人地中海贫血β654基因作为外源基因克隆入基础载体pBGT51质粒中构建了重组质粒βBGT51,用EcoRV酶切获得含人β654基因及βLCR调控序列的6.5kb的DNA片段,制备了可用于显微注射转基因的外源基因。结论采用该方法构建的含人地中海贫血β654基因的重组质粒,可获得用于显微注射转基因的外源基因。