纳豆激酶的分离纯化及生化研究

用固体发酵工艺制得的纳豆中含有大量溶栓活性成分———纳豆激酶。经过生理盐水浸提 ,(NH4 ) 2 SO4 分级沉淀 ,Sephadex柱层析等步骤 ,可以得一层析纯的纳豆激酶。冷冻干燥品经SDS—PAGE电泳显示有二组分存在     

纳豆激酶的分离纯化研究

从实验室保存的一株高产纳豆激酶菌株出发,进行发酵产酶,确立具有纤溶活力的纳豆激酶的分离纯化工艺,主要通过硫酸铵分级盐析法和Phenyl Sepharose疏水柱层析进行分离纯化,用纤维蛋白平板法测定酶活力,用SDS-PAGE电泳验证为电泳纯,分子量为28kD。其有望开发为新型的口服溶栓药物。     

纳豆芽孢杆菌菌种纯化及不同氮源对其产纳豆激酶的影响

纳豆激酶(nattokinase, NK)是一种由纳豆芽孢杆菌发酵产生的丝氨酸蛋白酶,具有良好的纤溶活性。本研究从wako Nattokinase中分离纯化出高品质的纳豆芽孢杆菌,旨在探究最适宜该菌产纳豆激酶的发酵培养基氮源。研究人员选择了6种氮源对其进行发酵实验,通过连续测定发酵液的菌量、pH和纤溶活性以观察不同氮源对纳豆芽孢杆菌产纳豆激酶的影响。研究结果表明:最优氮源为乳清蛋白,在以此为氮源的培养基中发酵培养120 h后,纳豆激酶的纤溶活性高达1 757.79 U/mL。以乳清蛋白发酵培养基对纳豆芽孢杆菌进行发酵,不仅可以得到高活性的纳豆激酶,还可为纳豆激酶应用于食品、保健品领域提供思路。     

高效溶栓酶——纳豆激酶的纯化及酶学性质研究

采用硫酸铵分步盐析,Sepharose CM FF离子交换层析和Superdex 75凝胶色谱,对纳豆激酶发酵液进行分离纯化,得到电泳纯的纳豆激酶。并研究了纳豆激酶的酶学性质,实验结果表明,纳豆激酶的最适作用温度为37℃,温度对酶稳定性影响显著;NK的最适作用pH为7.4,pH6~8范围内酶活相对稳定;EDTA、pepstatin、aprotin ine和PMSF对酶有抑制作用,而SBTI和TPCK对酶有激活作用,其中以EDTA的作用最为明显;Zn2 对酶活有较大的抑制作用;A l3 、Cu2 对酶也有一定程度的抑制;Mg2 、Ca2 、是较好的酶活稳定剂和促进剂。     

纳豆激酶基因的表达及纯化

利用PCR方法从分泌纳豆激酶的枯草杆菌基因组DNA中扩增得到纳豆激酶基因(NK),利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体pETNK。在诱导下,实现了在大肠杆菌中高效表达,经SDS-PAGE电泳分析和薄层扫描结果显示,表达的目的蛋白占菌体蛋白的21．5％。将表达产物经过DEAE-Cellulos-DE52和Sephedax-G100两个柱分离纯化,得到纯的纳豆激酶蛋白干粉,经琼脂糖-纤维蛋白平板法测出纳豆激酶干粉的溶栓活性相当于200u尿激酶。从基因工程角度研究纳豆激酶基因的克隆、表达及纯化,为用基因工程菌生产纳豆激酶奠定了基础。     

纳豆激酶集成化分离技术

综述了纳豆激酶的分离纯化技术的研究现状和发展趋势。通过对常规分离技术的分析,重点讨论了集成化分离技术的应用及其优势,包括集成化双水相分配技术、扩张床吸附技术以及耐盐性混合模式吸附技术等分离方法。并指出集成化分离技术在生产纳豆激酶以及其他活性蛋白方面,具有广阔的应用前景。     

一株产甘露聚糖酶菌株的分离鉴定及酶的纯化与性质

【目的】筛选性能良好的产碱性甘露聚糖酶的菌株,对菌株进行多项分类鉴定,分离纯化所产甘露聚糖酶并进行性质研究。【方法】利用碱性魔芋粉培养基分离纯化产甘露聚糖酶的嗜碱菌,通过形态特征观察、生理生化测定、16S rRNA序列分析等实验确定菌株的分类地位。利用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和分子筛层析得到电泳纯的酶,分析了酶的最适温度、最适pH、温度和pH稳定性、NaCl以及金属离子等的耐受性。【结果】从我国内蒙古碱湖样品中分离得到一株产碱性甘露聚糖酶的菌株HMTS15,经过多项分类鉴定显示其是与Bacillus agaradhaerens DSM 8721不同的新菌株。菌株HMTS15所产的甘露聚糖酶反应的最适pH为10.0,最适温度75℃。【结论】多项分类结果鉴定菌株为Bacillus agaradhaerens HMTS15。该菌株产生的碱性甘露聚糖酶与同类其他来源的酶相比具有更好的热稳定性和pH适应性,有进一步的研究价值。     

纳豆激酶的纯化及活力测定

利用SephadexG—100s柱凝胶层析法从纳豆菌（BacillusNatto）提取液中分离纯化出具有体外活性的纳豆激酶,并通过纤维蛋白平板法测定其纤溶活力,发现其具有较强的促进纤维凝块溶解的作用。     

产胶原酶的蜡样芽胞杆菌发酵条件优化及酶的分离纯化

【目的】优化蜡样芽胞杆菌R75E菌株产胶原酶的条件,并通过蛋白分离纯化技术获得高纯度胶原酶。【方法】利用单因素及正交试验优化蜡样芽胞杆菌R75E产胶原酶的发酵条件及发酵培养基,将发酵液离心除菌后得到粗酶液,对其依次通过硫酸铵分级沉淀、Butyl FF疏水层析及SuperdexTM 200凝胶过滤层析等方法对目标胶原酶进行分离纯化,利用SDS-PAGE电泳检测其纯度。【结果】优化后发酵条件为培养温度41°C、接种量6%、培养时间36 h,优化后发酵培养基为葡萄糖10 g/L、蛋白胨5 g/L、起始p H 7.0,粗酶液酶活力较优化前提高了2.9倍;将该粗酶液经过一系列纯化后得到纯度超过90%的胶原酶产物,其纯化倍数和回收率分别为18.4和1.1%。【结论】获得蜡样芽胞杆菌R75E的最佳产酶条件,并对胶原酶分离纯化的方法进行了探索,为微生物胶原酶的开发应用奠定基础。     

纳豆激酶酶原基因和纳豆激酶基因的克隆及在大肠杆菌中表达

目的：构建可高效生产有活性的纳豆激酶的大肠杆菌工程菌。方法：将纳豆激酶酶原（pro-nattokinase,pro-NK)基因和纳豆激酶（natokinase,NK)基因,并分别克隆到表达融合蛋白的高效表达载体pJN上,构建出表达质粒pJNK1和pJNK2,并转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：IPTG诱导下,两个融合蛋白的表达量均达到30%,活性检测显示表达纳豆激酶酶原融合蛋白的菌株pJNK-1(BL)诱导后菌体破碎上清的溶栓活性比表达纳豆激酶融合蛋白的菌株pJNK-2(BL)高2-3倍,结论：纳豆激酶酶原融合蛋白部分自减切产生纳豆激酶成熟肽。     

一株芽孢杆菌胞外多糖的分离纯化及其抗氧化性测定

基于实验室从新疆罗布泊沙漠筛选到一株芽孢杆菌, 研究了该菌胞外多糖的分离纯化工艺及其抗氧化性质。发酵液经离心, 抽滤等预处理后, 使用Sevag试剂除蛋白, 并以无水乙醇作提取溶剂, 通过正交实验确定最佳提取条件为: pH为7.0, 温度为4°C, 时间为1.5 h, 料液比为1:4。粗多糖溶解后上活性炭柱(1.5 cm ′ 24 cm), 用蒸馏水、60%乙醇及95%乙醇洗脱, 分离得到主要部分, 再经Sephadex G-100凝胶柱, 用0.2 mol/L的NaCl溶液洗脱, 硫酸苯酚法和考马斯亮蓝     

Purification and characterization of a propanol-tolerant neutral protease from Bacillus sp. ZG20

Abstract

A propanol-tolerant neutral protease was purified and characterized from Bacillus sp. ZG20 in this study. This protease was purified to homogeneity with a specific activity of 26,655?U/mg. The recovery rate and purification fold of the protease were 13.7% and 31.5, respectively. The SDS-PAGE results showed that the molecular weight of the protease was about 29?kDa. The optimal temperature and pH of the protease were 45?°C and 7.0, respectively. The protease exhibited a good thermal- and pH stability, and was tolerant to 50% propanol. Mg²⁺, Zn²⁺, K⁺, Na⁺ and Tween-80 could improve its activity. The calculated K_m and V_max values of the protease towards α-casein were 12.74?mg/mL and 28.57?µg/(min mL), respectively. This study lays a good foundation for the future use of the neutral protease from Bacillus sp. ZG20.     

NADP-Specific Glutamate Dehydrogenase from Alkaliphilic Bacillus sp. KSM-635: Purification and Enzymatic Properties

An NADP-specific glutamate dehydrogenase [L-glutamate: NADP⁺ oxidoreductase (deaminating), EC 1.4.1.4] from alkaliphilic Bacillus sp. KSM-635 was purified 5840-fold to homogeneity by a several-step procedure involving Red-Toyopearl affinity chromatography. The native protein, with an isoelectric point of pH 4.87, had a molecular mass of approximately 315 kDa consisting of six identical summits each with a molecular mass of 52 kDa. The pH optima for the aminating and deaminating reactions were 7.5 and 8.5, respectively. The optimum temperature was around 60°C for both. The purified enzyme had a specific activity of 416units/mg protein for the aminating reaction, being over 20-fold greater than that for deaminating reaction, at the respective pH optima and at 30°C. The enzyme was specific for NADPH (K_m 44 μM), 2-oxoglutarate (K_m 3.13 mM), NADP⁺ (K_m 29 μM), and L-glutamate (K_m 6.06 mM). The K_m for NH₄Cl was 5.96 mM. The enzyme could be stored without appreciable loss of enzyme activity at 5°C for half a year in phosphate buffer (pH 7.0) containing 2 mM 2-mercaptoethanol, although the enzyme activity was abolished within 20 h by freezing at ?20°C.     

一株芽孢杆菌的分离和鉴定

从中国农业科学院北京畜牧兽医研究所鸡舍附近土壤中分离到一株芽孢杆菌P-25,并进行了分子鉴定。通过形态鉴定、革兰氏染色、生理生化测定、16SrRNA序列分析和系统发育树构建,确定该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus),其16SrRNAGenBank登录号为GU271135。     

纳豆激酶基因的克隆及其在枯草杆菌中的表达

为研究纳豆激酶（nattokinase,NK)的生物化学性质,以纳豆芽胞杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增包含启动子及3‘端非翻译区的纳豆激酶全长基因序列。经鉴定后构建大肠杆菌－枯草杆菌穿梭表达质粒pBLNK,转化蛋白缺陷型枯草杆菌,筛选表达菌株。表达株培养15h后收集培养上清液,SDS－PAGE分析证实表达产物后,用超滤浓缩、分子筛、离子交换等步骤分离纯化重组NK,每升发酵液得纯度达95％的重组NK约100mg,比活性达12000u/mg。     

芽孢杆菌(Bacillus sp.)脂肽抗生素发酵工艺及分离纯化

微生物脂肽具有抗菌谱广、热稳定性高、低毒、低抗药性等优点,近年来受到国内外广泛关注。综述了芽孢杆菌脂肽抗生素的发酵和分离纯化工艺的最新研究进展。在发酵工艺中,培养基营养组成、发酵温度、搅拌转速和通气量等参数对脂肽的产量至关重要,碳源、氮源和金属离子的组成与配比都会影响芽孢杆菌的生长与产物的合成,适当控制搅拌转速和通气量可提高脂肽产量。此外,近年来一些新型发酵工艺,如泡沫回流、固定化细胞、无泡发酵、固态发酵等被用于脂肽生产,通过改进发酵方式,在降低成本的同时提高了脂肽抗生素产量。抗菌脂肽分离纯化的主要方法包括超滤、吸附、泡沫分离及色谱法等,这些方法相对于传统的酸沉和萃取,具有可连续生产、脂肽提取量高及成本低等优点。同时,多种纯化方法的组合应用大幅度提高了抗菌脂肽的提取效果,有效降低了成本,是脂肽抗生素分离提取的发展方向。     

类芽胞杆菌碱性果胶裂解酶的纯化与酶学性质表征

从类芽胞杆菌Paenibacillus sp.WZ008的发酵上清液中纯化得到一个高活力碱性果胶裂解酶,经SDS-PAGE电泳估算其亚基相对分子质量为4.5×104。通过对该酶进行酶学性质研究发现：该酶能催化裂解果胶酸、低酯果胶和高酯果胶;酶催化反应最适温度范围为55～60℃,最适pH为9.6,在最适条件下以低酯果胶为底物酶的比酶活达3 021.6 U/mg;Ca2＋能增强该酶的活力,而Mn2＋,Ba2＋和EDTA强烈抑制该酶活力;当没有Ca2＋存在时,高度酯化的果胶是该酶的最适底物,在4 mmol/L Ca2＋存在时,该酶以果胶酸为底物比酶活最高（25 467 U/mg）。该酶N端序列比对分析发现与类芽胞杆菌Paenibacillus amylolyticus strain 27c64果胶裂解酶高度同源。     

重组枯草杆菌纤溶酶的酶学性质研究

对一种重组枯草杆菌纤溶酶 (rBSFE)的酶学性质进行了初步研究 ,结果表明 :酶作用最适温度为 35℃ ;最适反应pH为 8.0 ;酶活性能被PMSF抑制 ,是典型的丝氨酸蛋白酶。通过与尿激酶进行比较 ,发现该酶对纤维蛋白有直接降解作用 ,而对于纤维蛋白原的敏感性则低于尿激酶 ,提示该酶具有直接溶栓作用 ,又不致引起出血 ,是一种有潜力的新型溶栓剂。     

嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.F26过氧化氢酶的分离纯化及性质研究

从一株低度嗜盐、兼性嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp．F26中纯化得到一种碱性过氧化氢酶,并对该酶进行了性质研究。纯化过程经硫酸铵沉淀、阴离子交换层析、凝胶过滤层析及疏水层析四步最终获得电泳纯的目标酶(纯化58．5倍)。该过氧化氢酶的分子量为140kD,由两个大小相同的亚基组成。天然酶分子在408nm处显示特征吸收峰(Soret band)。吡啶血色素光谱显示了酶分子以原卟啉Ⅸ(protoheme Ⅸ)作为辅基。计算获得酶的表观米氏常数为32．5mmol／L。该过氧化氢酶不受连二亚硫酸钠的还原作用影响,但被氰化物、叠氮化物和3．氨基．1,2,4-三唑(单功能过氧化氢酶的专一抑制剂)强烈抑制。以邻联茴香胺、邻苯二胺和二氨基联苯胺作为电子供体测定酶活时,该酶不显示过氧化物酶活性。同时,酶的N-端序列比对结果说明,该过氧化氢酶与单功能过氧化氢酶亚群有一定的相似性,而与双功能过氧化氢酶亚群及猛过氧化氢酶亚群均没有同源性。因此,本文将纯化的碱性过氧化氢酶定性为单功能过氧化氢酶。此外,该酶具有热敏感的特点,且酶活在pH5～9的范围内不受pH影响,此后,活性随着pH的升高而升高,并在pH 11处有明显的酶活高峰。20℃、pH 11条件下的酶活半衰期达49h。在pH 11的高碱条件下表现出最高活力和一定的稳定性,这在已报道的过氧化氢酶中还未见描述。同时,该酶也显示了良好的盐碱稳定性,0．5mol／L NaCl、pH 10．5条件下的酶活半衰期达90h。另一方面,本文所研究的过氧化氢酶是第一个来源于嗜碱微生物的同源二聚体单功能过氧化氢酶,也是第一个来源于天然碱湖的单功能过氧化氢酶,它能部分地反映出细胞抗氧化体系对相应环境的适应情况。     

芽孢杆菌WS-3L淀粉酶的纯化和特性的研究

芽孢杆菌WS-3L产生的α-淀粉酶AmyL经过多步纯化,酶的回收率为15.5%,比活提高了345倍.该淀粉酶能够有效水解淀粉生成麦芽寡糖.酶的最适反应温度为45℃,最适反应pH为6.5,在pH 7.0～8.0,40℃以下酶活较稳定;离子Cu2 、NH4 、Ag 、Hg 和EDTA、SDS对酶活力有显著抑制作用,而其他一些常见金属离子如Na 、K 则对酶活影响不大.AmyL对可溶性淀粉、直链淀粉、支链淀粉的Km值和Vmax分别为2.81 mg/mL、8.37 mg/mL、1.80 mg/mL和11.67 μmol/(min·mL)、10.00μmol/(min·mL)、13.33 μmol/(min·mL),表明支链淀粉是该酶的理想水解底物.玉米淀粉对AmyL有很高的吸附率,预示这可以作为酶快速固定的一个简易方法应用到实际生产中.