细胞内RT－PCR扩增免疫球蛋白重链可变区基因

通常,逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）需要高质量的ｍＲＮＡ,操作过程复杂,效率低且易受到ＲＮａｓｅ的破坏,为了简化操作,提高效率,用１０％甲醛盐溶液固定杂交瘤细胞,以ＮＰ－４０渗透化处理细胞后做ＲＴ－ＰＣＲ,获得了大约３５０ｂｐ的特异性免疫球蛋白重链可变区基因片段,与用同一对引物得到的常规ＲＴ－ＰＣＲ扩增产物一致。这项技术可用于获得特定结构基因片段,连结并扩增嵌合蛋白基因及构建多克隆免疫球蛋白文库等。     

史氏鲟免疫球蛋白重链可变区序列及多样性

为了研究史氏鲟免疫球蛋白重链可变区基因的组织结构和多样性,采用RTPCR技术从史氏鲟(Acipenserschrenckii)脾脏总RNA中获得了免疫球蛋白重链可变区cDNA克隆,随机挑取31个阳性克隆进行测序。结果表明:所有序列相同率高于75%,前导肽相同率高于90%,应属于同1个VH家族。其变异主要存在于互补性决定区,特别是CDR3区。在D片段序列中发现大量保守的基因序列(motif)。并发现多个VH基因片段可以共用一个J片段的现象。在基因组DNA重排过程中,VH片段可以与任意的D和J片段结合。此外,史氏鲟免疫球蛋白重链可变区的VH,D和J片段的随机重排外,外切核酸酶作用,以及在重排位点大量N,P片段的插入现象,都大大增加了鲟鱼免疫球蛋白的多样性。     

细胞内RT－PCR扩增免疫球蛋白重链可变区基因

通常,逆转录PCR(RT-PCR)需要高质量的mRNA,操作过程复杂,效率低且易受到RNase的破坏,为了简化操作,提高效率,用10%甲醛盐溶液固定杂交瘤细胞,以Np-40渗透化处理细胞后做RT-PCR,获得了大约350bp的特异性免疫球蛋白重链可变区基因片段,与用同一对引物得到的常规RT-PCR扩增产物一致.这项技术可用于获得特定结构基因片段,连结并扩增嵌合蛋白基因及构建多克隆免疫球蛋白文库等.     

抗人CD3单抗轻、重链可变区基因的克隆及序列分析

根据抗体基因可变区两端保守序列ＦＲ１和ＦＲ４,设计并化学合成轻重链ＰＣＲ扩增引物。从体外培养细胞ＵＣＨＴ１中提取总ＲＮＡ,反转录成Ｃｄｎａ,以Ｃｄｎａ为模板经ＰＣＲ扩增轻,重链可变区基因片段。将扩增片段克隆至Ｐｕｃ１９质粒,筛选阳性克隆并测序,序列分析结果为重链３６６ｐｂ,编码１２２个氨基酸,轻链３２７ｂｐ,编码１０９个氨基酸     

抗人小细胞肺癌单克隆抗体的重链变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

本文从抗人小细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞中抽提总RNA,合成第一链cDNA,直接用PCR技术(polymerase chain reaction)扩增出351bp的重链变区基因(V_H),克隆至pUCV_(NP)-PCR载体上,经筛选得一批插入片段为351bp的阳性克隆,经核苷酸序列分析研究,证实已获得了该单克隆抗体的重链可变区基因。     

单引物预掺入PCR与抗体可变区基因的体外放大

用针对引导序列的5′-引物和针对恒定区的3′-引物,常规PCR程序只使所选5株单抗10个可变区cDNA中的4个得到放大.新设计的程序增设了一个反应时相:94℃ 1 min,37℃ 6-8min,循环1-3次,只加入5′-引物,补充3′-引物后,转入常规PCR循环,10个可变区cDNA均获放大.此程序被命名为“单引物预掺入PCR”.     

抗人CD3单抗重,轻链可变区基因的体外扩增,克隆和序列分析

根据免疫球蛋白重链和轻链可变区基因５＇端序列和Ｊ区序列,化学合成适合于体外扩增抗体重、轻链可变区基因的二对引物。从体外培养的ＯＫＴ３杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ,反转录生成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ为模板,分别加入合成的重、轻链可变区引物进行ＰＣＲ,扩增出抗体重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ｐＵＣ１９质粒,筛选出阳性克隆,用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。所测重链可变区基因全长３５７ｂｐ,编码１１９个     

链霉菌看家基因引物的设计与验证

看家基因的扩增与测序是进行多基因系统进化分析首先需要解决的问题。针对链霉菌这一群高(G C)mol%革兰氏阳性细菌,选定4个看家基因:atpD、recA、rpoB和trpB,利用NCBI数据库中已有的2个链霉菌和3个分枝杆菌的全基因组序列,以及另两个链霉菌的recA基因序列,通过软件分析设计了各基因的扩增和测序引物,并优化了扩增反应条件。从所试验的55株链霉菌中,均特异地扩增出了上述4个基因的片段,并成功进行了序列测定,验证了所设计引物的实用性。所归纳的引物设计方法可用于高(G C)mol%革兰氏阳性细菌的其它看家基因,以促进多基因系统进化研究的开展。     

5种鲟鱼免疫球蛋白重链恒定区序列研究

为了探讨几种鲟鱼免疫球蛋白(IgM)所包含的信息与其亲缘和进化之间的关系, 分别对俄罗斯鲟(Acipenser. gueldenstaedtii)、小体鲟(A. ruthenus)、施氏鲟(A. schrenckii)、中华鲟(A. sinensis)和欧鳇(Huso huso)的IgM重链(IgH)恒定区进行了研究。采用RT-PCR的方法对IgH核酸序列进行了克隆, 通过软件获得了相应的IgH氨基酸序列。在分别对这5种鲟鱼免疫球蛋白重链恒定区4个区(CH1～CH4)进行研究后发现, 其CH4区氨基酸序列相似性最高。通过对CH4区序列氨基酸变异期望值(Kaa), 物种分化时间(T)及物种间系统进化树(Phylogenetic Tree)等参数的分析, 将克隆的5种鲟鱼IgH恒定区序列与已发表的西伯利亚鲟同源序列比对(源于NCBI序列)后发现: 西伯利亚鲟与俄罗斯鲟、施氏鲟与欧鳇、小体鲟各构成一个分支, 并与中华鲟相对。实验结果从体液免疫系统的演化这个角度, 反映了被研究的鲟鱼物种间的分类地位、地理分布及进化关系之间的联系。     

抗HFRSV人单抗可变区基因克隆及其序列测定

从杂交瘤细胞株87—2提取细胞总RNA．反转录合成cDNA链,进行PCR反应。其中扩增重链可变区一对引物分别与人免疫球蛋白重链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补;扩增人λ轻链可变区引物与人免疫球蛋白λ轻链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补。将重、轻链可变区基因的PCR扩增产物分别插入M13噬菌体．经转化筛选分别获得重组克隆。双脱氧法测定其序列,所得核苷酸序列经计算机分析,轻、重链可变区基因长度分别为309bp和405pb,编码103个氨基酸和135个氨基酸,有明显抗体可变区特征,具有骨架区和抗原互补区。     

甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体轻链和重链可变区基因的巢式PCR扩增及序列分析

目的：采用巢式PCR对甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链基因进行扩增,对获得的基因进行序列分析,并找出克隆鼠Igκ轻链和重链可变区基因的通用方法。方法：设计22对扩增鼠Igκ轻链可变区和重链可变区基因的引物,对6株鼠抗人甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链可变区基因进行克隆并测序,与NCBI公布的鼠免疫球蛋白序列比对分析。结果：巢式PCR方法可以有效避免单克隆抗体克隆过程的假基因,并且得到的单克隆抗体的氨基酸序列均符合鼠免疫球蛋白可变区特征。结论：建立了克隆鼠免疫球蛋白轻链和重链可变区基因的通用方法,为后期克隆鼠源性单克隆抗体的可变区基因提供了基础,并为研究甲型H1N1流感病毒血凝素与抗体的结合位点提供了实验数据。     

Detection of Flaviviruses by Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction with the Universal Primer Set

Using a universal primer set designed to match the sequence of the NS1 gene of flaviviruses, the virus RNA of dengue (DEN), Japanese encephalitis (JEV), powassan and langat of Flaviviridae were successfully amplified by polymerase chain reaction (PCR) via cDNA; and with different internal primers, the serotypes of the dengue viruses were identified. Of the 78 clinically diagnosed dengue fever patients, 18 patients were positive for DEN 1, 48 patients for DEN 2 and 8 patients concurrently infected with DEN 4. Of the 52 patients admitted with Japanese encephalitis (JE), 45 were determined to be JEV infections. By nested PCR, we completed the identification of flaviviruses within 2 days. The results show that seven primers have a potential value for rapid clinical diagnosis of flavivirus infections.     

人心肌肌球蛋白轻链1与重链和肌动蛋白的结合

在测得中国人心肌肌球蛋白轻链 1cDNA的核苷酸序列 ,并获得一株单克隆抗体 (HCMLC1 8)的基础上 ,用PCR方法 ,以中国人心肌肌球蛋白轻链 1的cDNA为模板 ,分别获得中国人心肌肌球蛋白轻链 1的各为 98个氨基酸的N端和C端片段cDNA的克隆并进行了表达。同时进行了其表达产物和大鼠心肌肌球蛋白重链和人心肌肌动蛋白以及单克隆抗体结合的研究 ,发现三者均和轻链 1的N端相结合 ,结合位点各不相同。这些结合位点可能均位于轻链 1的分子表面 ,而且如果轻链 1在实验状态下先与肌动蛋白结合 ,则有可能影响轻链与重链间的彼此结合。肌动蛋白在体外能以不同位点结合肌球蛋白重链和轻链 ,可能在肌肉收缩过程中具有重要的生理意义     

抗癌胚抗原嵌合重链与核心链霉亲和素基因的融合及表达

将抗癌胚抗原（ＣＥＡ）单克隆抗体的重链可变区与人的恒定区（Ｃγ３） 连接, 制备抗癌胚抗原嵌合重链用于放免治疗及其他导向治疗, 可减少人抗鼠抗体反应（ＨＡＭＡ） 。为纯化及核素标记抗体, 将嵌合重链基因与核心链霉亲和素基因融合。融合基因在大肠杆菌得到高效表达, 表达量占菌体总蛋白的２４ ％ 。ＳＤＳＰＡＧＥ 和蛋白质印迹图谱显示表达产物分子量为７０ ｋＤ, 与其基因编码蛋白质的理论推算值相符。以ＨＲＰ标记的生物素作为抗体进行蛋白质印迹, 在７０ ｋＤ 处可见表达条带, 表明融合蛋白能特异性地与生物素结合, 使嵌合重链经生物素柱进行廉价纯化成为可能。表达产物在胞内主要以不溶性的包含体存在, 经变性和复性处理后, ＲＩＡ 表明表达产物具有结合其特异性抗原ＣＥＡ的能力。     

Immunoglobulin heavy chain constant and heavy chain variable region genes in phylogenetically diverse species of bony fish

Summary Genomic DNA from 18 phylogenetically diverse species of bony fish was hybridized with probes specific for the channel catfish immunoglobulin heavy chain constant (CH) gene, as well as with immunoglobulin heavy chain variable (VH) probes specific for five channel catfish VH gene families. The results showed that CH probes strongly hybridized only to genomic fragments from other catfish species. In contrast, restricted DNA from most other species hybridized with at least two channel catfish VH probes. In those species whose DNA hybridized with multiple VH probes, the restriction pattern of hybridizing fragments was probe-dependent. These studies suggest that (1) the CH gene defined in channel catfish appears to share similarity only with CH genes in other catfish species, (2) families of VH genes appear to have diverged in early phylogenetic lineages of teleosts, and (3) VH genes similar to those defined in catfish appear to be widely represented in phylogenetically diverse species of teleosts.