洁净室环境监测用培养基贮存效期的验证及方法学确认

目的验证洁净室环境监测用培养基的贮存效期,同时对环境监测浮游菌、沉降菌及表面微生物检测方法进行确认。方法对连续3批次贮存0、90、120 d洁净室环境监测用胰酪大豆胨琼脂(Tryptose soya agar,TSA)培养皿和TSA(L-80)接触皿进行相应菌液适用性检查(包括促生长能力和无菌检查)验证试验;并对贮存120 d TSA培养皿和TSA(L-80)接触皿分别进行环境浮游菌和沉降菌、表面微生物最长采样时间检测,然后再进行促生长能力测试。结果 TSA培养皿和TSA(L-80)接触皿贮存120 d (2～8℃90 d,25℃30 d)的适用性检查结果均符合《中国药典》2015版(三部)对培养基质量控制的要求。贮存120 d TSA培养皿进行洁净室环境浮游菌(主动采样10 min)、沉降菌(暴露采样4 h),以及TSA(L-80)接触皿进行表面微生物(接触采样10 s)检测后均具有良好的促生长能力。结论通过验证试验,确定了环境监测用TSA培养皿和TSA(L-80)接触皿的贮存效期120 d(2～8℃90 d,25℃30 d),并确认了贮存后TSA培养皿进行洁净室环境浮游菌、沉降菌检测的有效性,以及TSA(L-80)接触皿进行表面微生物检测的有效性。     

HFRSV在平皿表面室温暴露后存活力的定量研究

将肾综合症出血热病毒布于玻璃平皿表面,室温条件下分别暴露0、30、60、90和120min,观察病毒的定量存活情况.结果在经过120min的暴露后,HFRSV的效价仍高达104.23 TCID50.这一结果为HFRS的流行病学及其防治研究提供了重要的基础数据.     

从新生儿血液中分离一株发酵乳糖的鼠伤寒沙门氏菌的报告

沙门氏菌一般不发酵乳糖,但有发酵乳糖的变种。我院于90年3月由新生儿血液中分离出1株发酵乳糖的鼠伤寒沙门氏菌。现报告如下。 1.一般特性:该菌为革兰氏阴性杆菌。在羊血琼脂平皿上菌落2mm大小,暗灰色,半透明、光滑、湿润、边缘整齐。在SS琼脂、麦康凯琼脂平皿上菌落无明显差别,呈淡红色。     

红色毛癣菌的生物学特性研究

目的 观察红色毛癣菌在不同温度、不同培养基上的生长和产孢情况,并对其进行分子生物学鉴定.方法 ①大培养:采用沙堡葡萄糖琼脂(SDA)和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平皿,27℃、35℃黑暗培养,测量菌落直径,绘成生长曲线.②小培养(钢圈法):采用SDA、PDA、溴甲酚紫乳固体葡萄糖琼脂(BCP-MSG)、乳蜜琼脂(M)和复合维生素B(VitB)培养基,27℃、30℃黑暗培养,观察镜下菌丝生长、孢子产生情况.③进行rDNA 18S和ITS序列测定.结果 在SDA,PDA上,27℃条件下菌落生长速度较35℃快;在5种培养基上,SDA、PDA产孢较快较多,复合维生素B培养基产孢较慢,但产生大分生孢子较多.30℃产孢更丰富.对部分菌株rDNA ITS、18S PCR扩增产物纯化后直接测序,结果在GenBank中比对、分析,相似度为98%～100%,均鉴定为红色毛癣菌.结论 SDA、PDA均为鉴定和分离红色毛癣菌的合适培养基.5种培养基均可用来刺激红色毛癣菌产孢,其中SDA、PDA产孢较早、较丰富.红色毛癣菌rDNA 18S和ITS序列测定是一种快速准确的红色毛癣菌分子生物学鉴定方法.     

氯氰菊酯降解菌草酸青霉SSCL-5分离鉴定及降解特性

为解决土壤中残留的菊酯类农药问题,通过富集筛选法从70余份土壤中获得一株高效分解利用菊酯类农药的微生物菌株SSCL-5,该菌株可在含1 000 mg/L的氯氰菊酯无机盐培养基中正常生长。经形态学及ITS测序鉴定,确定该菌为草酸青霉(Penicillium oxalicum),对多种高浓度菊酯类农药耐受。经紫外分光光度法及HPLC验证该菌株草酸青霉SSCL-5在无机盐培养基、28℃、180 r/min摇瓶培养24 h的条件下,对400 mg/L氯氰菊酯的降解率为97%。土壤室内试验证明该菌在土壤中,温度20-34℃、水分含量保藏40%-60%条件下,30 d可将土壤中400 mg/L的氯氰菊酯降解67.6%。     

D-核糖发酵条件研究

对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ptn15-1的发酵条件进行优化。采用优化后的培养基对发酵液的pH、发酵温度、摇床转速、接种量、装液量等进行单因素实验。确定发酵最适发酵条件为：pH7.0,发酵温度37℃;摇床转速180r/min,接种量10%,300mL三角瓶装30mL发酵液,发酵时间为68h。在此条件下,该菌的D-核糖产量从31.7g/L提高到43.1g/L,提高了35.9%。     

安徽省三种产地竹黄菌培养的初步研究

首次对安徽省三种产地的竹黄菌进行了组织分离培养和液体发酵,比较了该菌固体生长状况和液体发酵形成的竹红菌素产量。结果显示,广德卢村的菌种平皿生长速度为0．31cm／d,液体发酵产生的竹红菌素吸光度为0．21;宁国板桥菌种平皿生长速度为0．30cm／d,液体发酵产生的竹红菌素吸光度为0．30;休宁武城的竹黄菌平皿生长速度为1．85cm／d,菌株液体发酵产生的竹红菌素吸光度为O．39。结论表明,休宁武城菌种无论是平皿生长速度还是发酵形成的竹红菌素量都明显优于其它两地的菌株。     

大肠埃希菌生物被膜体外模型的建立及黄连水提物对其抑制作用的初步研究

建立大肠埃希菌生物被膜（biofilm,BF）在Ф30培养皿和96孔板表面形成的体外模型,并开展黄连水煎液对BF抑制作用的初步研究。选取临床分离的大肠埃希菌菌株,在Ф30培养皿中采用LB（Luria-Bertani medium）培养基系统复制体外BF模型,经银染后利用显微摄影系统观察BF形态;在96孔板中采用LB培养基系统复制体外BF模型,采用MTT法利用酶标仪测定OD值。将黄连水煎液作用于大肠埃希菌生物被膜体外模型,分别采用MTT法和银染法考察黄连水提物对大肠埃希菌生物被膜的影响。Ф30培养皿表面可以观察到黑染呈棉絮状的膜样物而空白组没有此样物质;96孔板中,模型组的OD值为4．191,空白组的OD值为0．069;药物作用24h后黄连组的BF明显少于空白对照组;80mg／mL的黄连水煎液即开始对大肠埃希菌生物被膜有抑制作用,抑制率为20．8％,生药浓度达到180mg／mL时为最佳抑制浓度,抑制率为70．23％。Ф30培养皿和96孔板表面可以形成大肠埃希菌生物被膜,黄连水煎液可以抑制和破坏早期及成熟BF,且其抑制作用表现出了一定的量效关系,此方法对黄连水煎液作用于大肠埃希菌生物被膜是可行且稳定的,为应用于临床试验奠定基础。     

聚乙二醇小檗碱液对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌生长的抑制作用

目的 明确聚乙二醇小檗碱液在琼脂培养基表面的抑菌特点,及其对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的标准菌株、抗生素敏感菌株与多重耐药菌株生长的抑制作用,研究评价药物在皮肤黏膜表面的抑菌作用的合理实验方法.方法 以大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌(标准菌株、抗生素敏感菌株和多重耐药菌株)为研究对象,用常量肉汤稀释法测定聚乙二醇小檗碱液的最低抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC);用平皿琼脂培养法和试管肉汤培养法测定不同浓度聚乙二醇小檗碱液的抑菌作用.结果 在不同浓度的聚乙二醇小檗碱液的作用下,在琼脂培养基表面上或肉汤培养基中细菌的生长受到明显抑制,抑制作用与小檗碱浓度正相关,且对抗生素敏感菌株和多重耐药菌株的抑制作用差异无统计学意义;聚乙二醇小檗碱液在平皿琼脂表面和试管肉汤中对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌抑制100％菌株的浓度分别为1 500和375 mg/L、1 500和375 mg/L.聚乙二醇小檗碱液在琼脂培养基表面的抑菌作用明显低于在肉汤培养基中的抑制作用,在琼脂培养基表面的抑菌浓度是肉汤培养基中的抑菌浓度的4倍.并且金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌之间差异无统计学意义.聚乙二醇小檗碱液必须达到肉汤培养基中4倍以上浓度时,才能获得抑制100％细菌在琼脂培养基表面生长的效果.结论 高浓度的聚乙二醇小檗碱液可以抑制皮肤黏膜表面的细菌,包括抗生素耐药菌株的生长;皮肤黏膜表面应用聚乙二醇小檗碱液的适宜浓度为1 500 mg/L.琼脂培养基法适用于评价药物在皮肤黏膜表面的抑菌作用.     

对血平皿及双相培养基两种培养方法的评价

目的:通过实践了解血平皿及双相培养基两种培养方法的差异性,提高阳性率.方法:将体液标本同时接种血平皿及双相培养基,按<全国临床检验操作规程>,根据分离菌株形态、氧化酶、触酶,选择相应的生化/药敏鉴定板,用美国DADE Behring公司生产的MicroScan AS-4微生物分析仪进行菌种鉴定及药敏试验.结果:364例标本血平皿131例为阳性,阳性率为36.0%(131/364),双相培养基164例为阳性,阳性率为45.1%(164/364).两种培养方法经统计学处理χ2=6.26,P<0.05.两种培养方法总阳性率为53.3%(194/364).如将标本仅接种血平皿,漏检率达17.3%(63/364),标本只接种双相培养基,漏检率达8.2%(30/364).结论:将体液标本同时接种上述两种培养基进行培养,可使阳性率有较大的提高.     

氧化亚铁硫杆菌的形态及对Fe2+的氧化研究

在纯培养的条件下,对江西德兴铜矿酸性矿坑水中分离出的一株氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)的细胞形态、生长条件以及对Fe2 的氧化进行了初步研究。透射电子显微镜检查的结果表明,其成熟菌体大小均一,有较好的运动性;采用光学显微镜对微生物进行菌群观测和利用血小板计数器法对细菌计数的结果表明,在摇床转速为160r/min的条件下,T.f.菌在9K液体培养基中最适生长条件为温度30℃左右,最佳初始pH 2.0;用重铬酸钾滴定法测定铁的结果表明,在摇床转速为160r/min的条件下,pH值1.7,温度30℃时T.f.菌对Fe2 的氧化速率最大,约为0.58g/L·h。     

菊花茎尖的玻璃化超低温保存研究

本文建立了适合中国菊花种质资源长期保存的玻璃化超低温保存技术体系.在4℃下,把1～2mm的菊花茎尖放在含0.4mol/L蔗糖的MS培养基上暗培养2～3d,用预处理液在25℃下处理30min,再用玻璃化试剂PVS2在冰浴条件下处理15min,换新鲜的PVS2试剂并迅速投入液氮.液氮保存24h后,40℃水浴解冻2min,用含蔗糖1.2mol/L的MS液体培养基洗涤20min,滤纸吸干后接种到恢复培养基中,在25℃条件下弱光培养1～3d转入正常光照培养条件下培养,2周后成活率可达86%以上,成活的茎尖均可再生.     

生防工程菌株BS-17A稳定性与抑菌活性初步研究

目的:BS-17是内生细菌,对番茄灰霉病菌、叶霉病菌和枯萎病菌具有显著抑菌活性,为了跟踪研究野生型菌株BS-17在番茄根围和叶围的定殖情况,构建了1株带有黄绿荧光蛋白基因标记的生防菌株BS-17A.方法:采用NYD连续培养的方法和平皿抑菌试验的方法对工程菌株的遗传稳定性和抑菌活性进行了初步研究.结果:该工程菌在无选择压力培养基中连续培养50h,质粒遗传稳定性为94%,对番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、叶霉病菌Cladosporiumfulvum和枯萎病菌Fusarium oxysporum的抑制作用与野生菌无显著差异,平皿抑菌率分别为85.5%、86.5%和89.8%.结论:该工程菌具有较强的遗传稳定性和抑菌活性.     

培养基对透明颤菌生长的影响

目的:为了从环境中分离透明颤菌(Vitreoscilla),对培养基和生长条件进行了优化。方法:采用富集培养的方法,对透明颤菌生长的培养基成份进行了筛选试验。结果:在培养温度为32±2℃,50ml/500ml三角瓶,pH 7.8,醋酸钠浓度为0.02%,摇床转速120r/min条件下,透明颤菌生长最佳培养基是:酵母粉0.7%,蛋白胨0.3%。结论:透明颤菌在上述培养基中生长12h可达到高峰。     

HFRSV在平皿表面室温暴露后存活力的定量研究

将肾综合症出血热病毒布于玻璃平皿表面,室温条件下分别暴露０、３０、６０、９０和１２０ｍｉｎ,观察病毒的定量存活情况。结果在经过１２０ｍｉｎ的暴露后,ＨＦＲＳＶ的效价仍高达１０４．２３ＴＣＩＤ５０。这一结果为ＨＦＲＳ的流行病学及其防治研究提供了重要的基础数据。     

人体肠道细菌寡营养培养组条件的优化研究

【目的】探讨寡营养对人体肠道细菌培养组的条件。【方法】通过稀释富集培养基、固体平板和增菌肉汤培养基成分获得寡营养培养基。对健康人粪便样本分别用原液(0)、5、10、20、30和40倍稀释的富集培养基(添加羊血和瘤胃液的血培养瓶)连续增菌,在不同时间点(第0、3、6、9、15、27、30天)吸取增菌液,用YCFA (yeast casitone fatty acid)固体培养平板分离菌落;用YCFA增菌肉汤增菌后再次挑取单菌落,利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF)质谱和16S rRNA基因测序鉴定菌株。通过比较上述6种寡营养条件分离肠道菌群的效果,选取富集培养基原液、稀释10倍和30倍这3 种条件下分离效果较好的富集条件,与同样稀释倍数条件的固体平板和增菌肉汤分别组合成9种培养基条件,进一步优化肠道菌群的培养组条件。【结果】在6种寡营养富集培养基中,未稀释(原液)、10 倍和30倍稀释的富集培养基分离细菌的种类比其他...     

细菌科间原生质体融合的研究

本文将赖氨酸产生菌——北京棒杆菌1134株进行标记,同时将枯草芽孢杆菌BR151菌株进一步标记后,进行科间原生质体融合的探讨,揭示了科间原生质体融合的可能性。经适宜的条件培养和预处理,再在适宜的条件下,酶解制备亲本株的原生质体,用PEG(MW6000)为聚合剂,经低温短时间处理,将1134衍生株与151衍生株的原生质体进行融合;并在改良的DM_3平皿上加入适量的细胞壁碎片(作引物)与适量的人血清白蛋白制剂,使其再生,结果棒杆菌(在酶解后2.5h.)与枯草芽孢杆菌(酶解后20min)的制备率均已达到99.98％以上,再生率分别达21.3％与90.8％以上。经适温培养48h后,从融合平皿上随机挑出若干个菌落。点种于CM母平皿上,再分别影印于10套选择培养基平皿上,进行鉴定,其融合率达到了3.9×10~(-4)。从菌落形态和菌体形态上可大体分为近1134类型,近151类型和中间类型三种。经连续传代五代后,从融合子中筛选山了几株在摇床上以甜菜糖蜜为原料。产酸水平捉高近一倍的稳定高产融合子。其中Q4413株的产酸率平均达6.56％,10立升小罐发酵产酸率6.52％,糖酸转化率为40.25％,经进一步验证,该菌株的产酸能力和遗传性均是稳定的,为远缘工业微生物育种开辟了新的可行途径。     

酿酒酵母产D-乳酸重组菌的构建与发酵

采用基因工程方法对酿酒酵母进行代谢改造,使酵母产生乳酸代谢途径。将来源于L.mesenteroides和E.coli的D-乳酸脱氢酶基因,分别插入带有G418抗性的酵母穿梭质粒p YX212-kan MX上,电转化酵母,得到2株生产D-乳酸的酿酒酵母重组菌S.cerevisiae WE1510和S.cerevisiae WB1186。进一步摇瓶发酵试验表明:重组菌S.cerevisiae WB1186在YEPD培养基、20 g/L糖、p H 5的条件下生长条件最好,并具有更好的产乳酸能力。经3 L发酵罐条件下验证,S.cerevisiae WB1186分批发酵96 h,最终乳酸积累量达到18.0 g/L;发酵条件为培养基YEPD,接种量10%,溶解氧(DO)30%,转速150 r/min,初始葡萄糖质量浓度10 g/L,控制pH 5.0,通气量3 L/min,OD600最大值转为厌氧发酵。     

手掌参内生菌分离条件的研究

目的:确立药用植物手参内生菌分离的最佳条件。方法:采用两种不同的培养基(PDA培养基和改良PDA培养基)及不同的消毒时间来确定手参内生菌分离最佳条件。结果:改良PDA培养基为分离手参内生菌最佳培养基,2min消毒时间为最佳消毒时间。结论:培养基的种类及消毒时间对内生菌分离有着重要的影响。     

去壁酶与酶解方式对曲霉原生质体释放的影响

研究了纤维素酶、蜗牛酶、溶菌酶以及菌丝体培养方式和酶解方式对黑曲霉和米曲霉菌丝释放原生质体的效应。发现黑曲霉菌丝原生质体制备最佳条件为固体透析培养菌丝体,2%纤维素酶,在平皿中,28℃和80r/min条件下酶解3h;米曲霉原生质体制备最佳条件为2%纤维素酶+1%蜗牛酶+5mmol/L二硫苏糖醇,酶解时间6h,其它条件与黑曲霉的相同。