拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类进化酶的获得及其特性分析

拟南芥谷胱甘肽S-转移酶Zeta类(AtGSTZ)是一种与细胞代谢和环境净化密切相关的多功能酶.应用易错PCR和多轮DNA洗牌技术构建了AtGSTZ随机突变文库;再利用pH指示剂颜色改变法对突变文库进行筛选,获得了9个二氯乙酸脱氯活性提高的突变子.其中,NN23含25个氨基酸突变,比活力提高120%,NN20含24个氨基酸突变,比活力提高102%,EC1含2个氨基酸突变,比活力提高47%,其他6个为单点突变,比活力分别提高9%～60%.酶学分析显示,所有进化酶对底物二氯乙酸的催化效率和对谷胱甘肽的亲和力以及个别进化酶的复性能力都得到不同程度的提高,但热稳定性均没有明显改善.同时,对一系列与AtGSTZ空间折叠及催化活性相关位点进行了讨论.     

谷胱甘肽S-转移酶的诱导表达及提纯

含有日本血吸虫谷胱甘肽S -转移酶基因的质粒 pGEX - 5X - 1在大肠杆菌BL2 1 (DE3)菌株中得到表达。 37℃[1 ]下用 1 %乳糖诱导谷胱甘肽S -转移酶 (GST)的最适表达时间为 3h。盐析粗提酶液并以Habig法[2 ] 监测GST的活性 ,用pH6 .0 ,饱和度为 30 %硫酸铵去除杂蛋白 ,并调 pH7.5 ,饱和度 70 %硫酸铵使GST大量析出并保持活性。用透析法脱盐 ,并用Sephadex -G5 0凝胶对GST进行了初步纯化。初步探讨了GST的保存方法     

昆虫谷胱甘肽S-转移酶的基因结构及其表达调控

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferases, GSTs）属于一个超家族,目前已从20多种昆虫中克隆得到了近百个GSTs基因序列。这些基因分属于至少3个类别,Ⅰ（Delta）类,Ⅱ类和Ⅲ（Epsilon）类,其中Ⅰ类和Ⅲ类是昆虫特异性的类别。昆虫Ⅰ类GSTs基因通常由多基因家族编码,基因多态性在不同昆虫种类中差异很大。Ⅱ类基因的种类较少,基因的结构较简单,通常是单拷贝基因。Ⅲ类基因是最近才鉴定出来的新类别,目前仅在黑腹果蝇和冈比亚按蚊中明确了其在染色体上的定位。基因簇、可变剪接和基因融合等机制是导致昆虫GSTs基因多态性的主要原因。在抗性昆虫种群中,GSTs表达量的增加有mRNA水平的提高和基因扩增两种机制,但后一种机制的报道很少。GSTs活性的增加是由于属于一类或多类的多个同工酶的增量调控,也有少数是由于单个同工酶的增量调控。GSTs的表达受反式调控元件和顺式调控元件的调控。目前仅有少数含有调节基因的染色体大致位点和可能的调控元件得到鉴定。     

火把梨谷胱甘肽S-转移酶基因的克隆与表达

依据火把梨编码谷胱甘肽S-转移酶(GST)的EST序列设计基因特异引物,采用快速扩增cDNA末端技术,从云南火把梨中克隆到一个新的GST基因的全长cDNA序列。该基因被命名为PpGST(GenBank登录号为HQ889136)。PpGST全长cDNA为1 177bp,具有130bp 5′-UTR、696bp ORF以及351bp 3′-UTR,编码含231个氨基酸的蛋白质。与已知植物GSTs家族成员间的氨基酸序列聚类分析将PpGST聚为zeta类GST。RT-PCR分析显示,PpGST在火把梨光照的果皮和没有光照的果皮中大量表达,并且表达强度不受光照时间的影响,而在幼嫩叶片中没有表达。研究结果暗示在果皮中大量表达的PpGST可能参与维持火把梨果实发育过程中的氧化还原平衡及应答逆境胁迫。     

西伯利亚蓼谷胱甘肽转移酶和半胱氨酸合成酶基因在酿酒酵母中的共表达

谷胱甘肽转移酶和半胱氨酸合成酶在清除活性氧（reactive oxygen species,ROS）中起重要作用。采用0．36mol·L^-1 NaHCO3对西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum）进行胁迫处理,荧光定量PCR分析表明这2个基因的表达受盐胁迫强烈诱导。为了分析2个基因是否具有抗盐能力以及其相互协同能力,从cDNA文库中获得谷胱甘肽转移酶（GST）和半胱氨酸合成酶（Cs）2个基因,分别将GST、CS和GST＋CS转入酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中,并分别命名转基因酵母为ty-gst、tycs和ty-gc。在1mol·L^-1 Na2C03和5mol·L^-1 NaCl胁迫处理下,转基因酵母（ty-gst、ty-cs和ty-gc）的耐盐能力均明显高于野生型酵母（㈣,而三者之间并无显著差别。在0．4mol·L^-1 NaCl胁迫处理下,转基因酵母（ty-gst、ty-cs和ty-gc）的抗氧化酶类相关基因SOD1、SOD2、GPX1和GPX3的表达量均低于野生型酵母（对照）（wy）,而CTA7表达量均高于野生型酵母（对照）（wy）。转基因酵母ty-cs在0．4mol·L^-1 NaCl胁迫处理前后其超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（catalase,CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxJdase,GPX）的活性均表现为最高。     

西伯利亚蓼谷胱甘肽转移酶和半胱氨酸合成酶基因在酿酒酵母中的共表达

谷胱甘肽转移酶和半胱氨酸合成酶在清除活性氧(reactive oxygen species,ROS)中起重要作用。采用0.36 mol.L-1NaHCO3对西伯利亚蓼(Polygonum sibiricum)进行胁迫处理, 荧光定量PCR分析表明这2个基因的表达受盐胁迫强烈诱导。为了分析2个基因是否具有抗盐能力以及其相互协同能力, 从cDNA文库中获得谷胱甘肽转移酶(GST)和半胱氨酸合成酶(CS)2个基因, 分别将GST、CS和GST+CS转入酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中, 并分别命名转基因酵母为ty-gst、tycs和ty-gc。在1 mol.L-1 Na2CO3和5 mol.L-1 NaCl胁迫处理下, 转基因酵母(ty-gst、ty-cs和ty-gc)的耐盐能力均明显高于野生型酵母(wy), 而三者之间并无显著差别。在0.4 mol.L-1 NaCl胁迫处理下, 转基因酵母(ty-gst、ty-cs和ty-gc)的抗氧化酶类相关基因SOD1、SOD2、GPX1和GPX3的表达量均低于野生型酵母(对照)(wy), 而CTA1表达量均高于野生型酵母(对照)(wy)。转基因酵母ty-cs在0.4 mol.L-1 NaCl胁迫处理前后其超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)的活性均表现为最高。     

山葡萄谷胱甘肽S-转移酶基因（VAmGST4）克隆及表达分析

采用RT-PCR和SMART RACE技术克隆了山葡萄VAmGST4基因的全长cDNA序列,GenBank登录号为FJ645770,基因全长885bp,包括开放阅读框（ORF）642bp,编码213个氨基酸。该基因表达产物相对分子质量为24.24kDa,等电点为5.72,是不稳定蛋白;该基因属于GST超基因家族,不包含信号肽。氨基酸序列与欧亚种葡萄（AY971515）、荔枝（EF613493）、矮牵牛（Y07721）、紫苏（AB362191）和玉米（EU964162）等植物的GST氨基酸序列的同源性系数分别为99%、67%、64%、61%和47%。半定量PCR显示,在果实着色过程中,VAmGST4在果皮中表达随花色苷的合成上调;在茎、果肉和果皮中均有表达,而在叶片中不表达,表明VAmGST4的表达与花色苷的生物合成密切相关。     

谷胱甘肽S-转移酶与昆虫抗药性的关系

谷胱甘肽S -转移酶 (GSTs)是一种对杀虫剂产生代谢抗性的重要酶系 ,参与许多分子的解毒机制 ,并可转运一些重要的亲脂性化合物。GSTs在保护组织以抵御氧化侵害及氧化压力中起重要的作用。GSTs是昆虫及螨类对有机磷类杀虫剂产生抗生的重要因素     

谷胱甘肽S-转移酶Pi在MAPK途径中的调节作用

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)是细胞内降解生物异源物质(xenbiotics)的一类酶,GSTπ／GSTpi／GSTp是人体内的一种重要活性亚型;有丝分裂原激活的蛋白激酶(mitogen—activated protein kinase,MAPK)途径能够调节真核细胞凋亡、增殖、分化和应激。1999年国际上首次报道GSTpi能够在MAPK信号途径中起调节作用,其作用机制如下：在正常生长条件下,GSTpi以单体形式与JNK(c—Jun N—terminal kinase)形成复合物,抑制JNK活性;UV照射或H2O2处理细胞后,GSTpi自身形成二聚体／多聚体,导致GSTpi—JNK复合物解离,JNK的抑制被解除,JNK被磷酸化激活后激活转录因子c—Jun,c—Jun的激活能进一步促进GSTpi基因的转录,进而合成新的GSTpi蛋白单体,该单体又能反馈抑制JNK。后续研究发现GSTpi也能够抑制JNK激酶的上游激酶ASK1的活性。上述研究揭示GSTpi酶在细胞内除能通过降低异源物质而改变细胞的ROS平衡外,其蛋白本身还具有特异性地抑制MAPK信号转导途径中JNK激酶和JNK上游激酶的新功能。     

东亚飞蝗谷胱甘肽S-转移酶分离纯化

通过硫酸铵沉淀技术和GSH-agarose亲和层析对东亚飞蝗Locusta migratoria manilensis(Meyen)5龄若虫谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferases,GSTs)进行了分离纯化。结果表明GSTs活性在硫酸铵各沉淀段均有分布,但在55%～100%沉淀段活性较高,在硫酸铵饱和度为85%时比活力最高,达到420.33μmol/min/mg protein,纯化倍数为18.86。根据硫酸铵粗沉淀谷胱甘肽S-转移酶结果,选择硫酸铵浓度为60%～90%沉淀段进行GSH-agarose亲和层析,纯化后比活力最高达到1365.29μmol/min/mg protein,纯化倍数达到61.25。经SDS-PAGE鉴定,得到的GST为1条带,亚基的分子量约为24kDa。     

谷胱甘肽硫转移酶基因表达的调控

催化内源性或外源性亲电子化合物与谷胱甘肽(GSH)结合的谷胱甘肽硫转移酶(GST)超基因家族是一族解毒功能蛋白.其基因的表达通过不同的机制受多种物质的调控.根据最近文献资料,对调控谷胱甘肽硫转移酶基因表达的基因结构、调控机制及氧化应激对谷胱甘肽硫转移酶基因表达的调控作用等作一简要综述.     

纤维素酶在酿酒酵母中的表达研究

统合生物加工过程（Consolidated bioprocessing,CBP）具有应用于纤维素乙醇生产的潜力,而该技术的关键是构建能有效降解纤维素的工程菌株。酿酒酵母是传统的乙醇发酵菌株,作为CBP宿主菌株具有很多优势,因此在酿酒酵母中表达纤维素酶引起研究者的普遍关注。综述了纤维素酶基因在酿酒酵母中表达的影响因素,包括基因表达盒表达元件（启动子、信号肽和终止子等）、纤维素酶基因拷贝数及存在形式以及纤维素酶基因来源等,并对一种和多种纤维素酶基因在酿酒酵母中的表达及构建得到的CBP菌株研究进展做了简要介绍。     

Evolution of the Catalytic Activity of Arabidopsis thaliana Glutathione Transferase Zeta Class-1 by Saturation Mutagenesis

Saturation mutagenesis was performed on three non-catalytic residues, Asn71, Leu108, and Gly177, in and near the active site of Arabidopsis thaliana GSTZ-1 (AtGSTZ-1). Forty unique mutants with more than 10% activity increases, were obtained. Of these, 12 resulted in large activity improvement and were purified for further characterization. Remarkably, 11 of them contained mutations at Leu108, suggesting that Leu108 plays an important role in dichloroacetic acid-dechlorinating (DCA-DC) activity. Kinetic analysis revealed that multiple mutations at these residues increased k _cat/K _m toward DCA and GSH by as much as 2.2- and 5.8-fold, respectively. Since the catalytic residues were not involved in mutagenesis, the activity enhancements were presumably due to structural change in the active site rather than to a change in catalysis. Our results also suggest that the specific shape of the active site in AtGSTZ-1 is essential to its unique DCA-DC activity.     

Characterization of gamma-glutamylamidase-glutaminase activity in Saccharomyces cerevisiae

In a foregoing paper we have shown the presence in the yeast Saccharomyces cerevisiae of an enzyme catalyzing the hydrolysis of L-gamma-glutamyl-p-nitroanilide, but apparently distinct from gamma-glutamyltranspeptidase. The cellular level of this enzyme was not regulated by the nature of the nitrogen source supplied to the yeast cell. Purification was attempted, using ion exchange chromatography on DEAE Sephadex A 50, salt precipitations and successive chromatographies on DEAE Sephadex 6B and Sephadex G 100. The apparent molecular weight of the purified enzyme was 14,800 as determined by gel filtration. As shown by kinetic studies and thin layer chromatography, the enzyme preparation exhibited only hydrolytic activity against gamma-glutamylarylamide and L-glutamine with an optimal pH of about seven. Various gamma-glutamylaminoacids, amides, dipeptides and glutathione were inactive as substrates and no transferase activity was detected. The yeast gamma-glutamylarylamidase was activated by SH protective agents, dithiothreitol and reduced glutathione. Oxidized glutathione, ophtalmic acid and various gamma-glutamylaminoacids inhibited competitively the enzyme. The activity was also inhibited by L-gamma-glutamyl-o-(carboxy)phenylhydrazide and the couple serine-borate, both transition-state analogs of gamma-glutamyltranspeptidase. Diazooxonorleucine, reactive analog of glutamine, inactivated the enzyme. The physiological role of yeast gamma-glutamylarylamidase-glutaminase is still undefined but is most probably unrelated to the bulk assimilation of glutamine by yeast cells.     

pH及流加葡萄糖对酵母分批发酵生产谷胱甘肽的影响

在5 L的发酵罐中研究了pH及流加葡萄糖对酵母分批发酵生产谷胱甘肽(GSH)的影响。实验考察了不同浓度的流加葡萄糖和不同的恒pH值的分批发酵对于酵母生产GSH产量的变化。实验结果表明,当pH值控制为5.0,流加葡萄糖流速为5g.L-1.h-1,连续流加30 h,可使GSH产量最高,与之前未流加葡萄糖和控制pH相比,其产量提高了6倍。     

补料方式对酵母菌生产谷胱甘肽的影响

比较了酵母菌发酵生产谷胱甘肽（GSH）的几种补料分批培养方式。实验发现补料可以明显地促进酵母菌的生长和谷胱甘肽的合成,同时还发现不同的补料方式对发酵液中的菌体浓度和GSH浓度有不同的影响。采用指数流加方式可获得极高的菌体浓度,但菌体中的GSH浓度较低;而采用恒－pH补料分批培养既可以达到较高菌体浓度,菌体中又含有较高的GSH含量,因此,其总的GSH产量最高,可达到977.8mg/L。     

苹果酸降解相关基因在酿酒酵母中的表达

微生物降酸是现代葡萄酒酿造重要工艺。将裂殖酵母苹果酸通透酶基因(mae1)和苹果酸酶基因(mae2)克隆到酿酒酵母中,构建了苹果酸酒精酵母;将mae1基因和乳酸乳球菌的苹果酸乳酸酶基因(mleS)克隆到酿酒酵母中,构建了苹果酸乳酸酵母。构建的酵母重组子能够有效地分解发酵基质中的苹果酸。