金钗石斛生物碱的组织化学定位研究

利用组织化学定位方法对金钗石斛不同生长年限和不同营养器官的生物碱分布和积累进行比较分析。结果表明,金钗石斛茎生物碱主要分布于基本组织,三年生金钗石斛的生物碱含量高于一年生和二年生金钗石斛。金钗石斛根部生物碱含量同样较多,主要分布于皮层薄壁细胞中;金钗石斛叶片生物碱含量较低,存在于上下表皮细胞中,与铁皮石斛和铜皮石斛完全不同。说明三年生金钗石斛作为最适宜采收期,而且金钗石斛根部具有很好的开发利用价值。金钗石斛叶片表皮细胞中呈现生物碱的原因尚未清楚,需要进一步研究。     

石斛属植物茎部总RNA提取方法的研究

获得快速提取高质量石斛属植物茎总RNA的方法,为深入开展分子生物学研究奠定基础。采用7种方法提取铁皮石斛茎总RNA,凝胶电泳和紫外分光光度法检测质量,筛选最佳方法,并对方法进行验证。结果显示,经过比较,用改良华越洋多糖多酚试剂盒法(M7)提取的铁皮石斛茎总RNA的完整性、浓度和纯度均最好。用M7提取铁皮石斛、金钗石斛、鼓槌石斛、球花石斛和重唇石斛的茎总RNA,以及提取不同生长条件(温室和大棚种植)和不同生长时间(大棚生长3个月、1年和2年)铁皮石斛的茎总RNA,所获样品的完整性、浓度和纯度均符合质量要求。M7操作简便,结果重复性好,适于石斛属植物茎总RNA的提取。     

GA3、6-BA对金钗石斛生长发育及生物碱含量的影响

在金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)高分蘖期前用GA3和6-BA进行浸根处理,分析GA3和6-BA对金钗石斛生长发育及生物碱含量的影响.结果表明:GA3、6-BA处理使金钗石斛SOD、POD活性升高,可溶性蛋白质和可溶性糖含量增加; 用0.5～1.0mg·L-1GA3和10 mg·L-16-BA处理可使金钗石斛的总生物碱含量分别增加6.7%～10.1%和3.4%;石斛碱的含量不受GA3和6-BA的影响.0.5～1.0 mg·L-1 GA3和10～50 mg·L-1 6-BA处理可使金钗石斛生物产量分别增加13.3%～30.7%和17.3%～40.0%,有效分蘖率提高63.2%～68.9%和63.1%～82.1%,GA3可显著促进茎的延长生长.内源IAA含量在5-8月份较高,其中以6月份含量最高(4.84 μg·g-1),1月份最低(2.97 μg·g-1);内源ABA含量在1月份达最高(0.61 μg·g-1).用含有1.0 mg·L-1 GA3和50 mg·L-1 6-BA的激素营养液处理可以显著提高金钗石斛生物产量(比CK增产38%),而且总生物碱含量也增加5.6%.     

太空诱变对金钗石斛光合特性和生长的影响

为了解太空诱变对金钗石斛(Dendrobium nobile)生长发育的影响,对太空诱变和野生金钗石斛的叶片结构、光合特性和生长指标进行了比较研究。结果表明,太空诱变后的金钗石斛叶片较厚,叶气孔密度大、气孔器长轴和短轴长度均变长。两种金钗石斛的光合速率日变化趋势相似,均为双峰型曲线,但太空诱变的净光合速率低于野生的。太空诱变和野生金钗石斛最大净光合速率分别为4.6和6.8μmol m~(–2)s~(–1),光补偿点分别为18.3和12.6μmol m~(–2)s~(–1),光饱和点分别为1180和720μmol m~(–2)s~(–1)。太空诱变和野生金钗石斛的CO_2补偿点分别为100和102μmol mol(–1),CO_2饱和点分别为2215和2090μmol mol(–1)。太空诱变的金钗石斛单茎鲜重和干重均低于野生种,但由于其分蘖数增加,每盆的总生物量反而增加;太空诱变的金钗石斛生物碱和石斛多糖含量显著高于野生种。因此,太空诱变为金钗石斛育种和品质改良提供了新途径。     

石斛属4种植物中滨蒿内酯的含量测定

通过薄层扫描法测定了迭鞘石斛、短棒石斛和晶帽石斛中滨蒿内酯的含量,为中药石斛的开发利用提供依据。     

群体表型性状研究揭示环境与遗传因素对霍山石斛表型及物种分类的影响

石斛属(Dendrobium)种类繁多, 属内物种具有丰富的表型多样性。霍山石斛(D. huoshanense)为我国特有物种, 其与河南石斛(D. henanense)和细茎石斛(D. moniliforme)以及铁皮石斛(D. catenatum)等近缘种表型相似, 在分类处理中存在争议。这种争议很大程度上与植物普遍存在的表型可塑性和代际共存有关。为探究环境和代际间遗传因素对霍山石斛表型性状的影响以及霍山石斛与近缘种的物种边界问题, 本研究观测了安徽省霍山县霍山石斛(野生、林间和温室F₁代、林间和温室F₂代)、野生河南石斛、细茎石斛和铁皮石斛, 共计16个群体2,279株植株的假鳞茎茎长等12个表型性状; 在种内层面, 首次借鉴生态学同质园实验和遗传学代际间性状比较的方法, 对霍山石斛群体表型性状进行差异显著性检验和95%置信区间比较以及主成分和变异系数等统计学分析。在种间层面, 对霍山石斛与河南石斛和铁皮石斛等近缘种群体表型性状进行比较和分析。结果表明, 环境因素对霍山石斛假鳞茎茎长和假鳞茎直径等具有显著的影响, 代际间遗传因素对霍山石斛假鳞茎直径具有显著的影响。霍山石斛与铁皮石斛和细茎石斛等近缘种群体在假鳞茎茎长、假鳞茎直径、花瓣长和花瓣宽等表型性状方面均存在显著性差异和间隔, 但与河南石斛仅在假鳞茎表型性状方面有显著性差异。我们的研究明确了环境和代际间遗传因素对霍山石斛表型性状的影响程度, 为霍山石斛与近缘种等争议物种的分类和鉴定提供了表型证据。     

3种石斛多糖及其降血糖活性的比较研究

天然多糖安全、低毒,是潜在糖尿病治疗药物。为寻找活性高、含量高的植物多糖资源,本文从多糖得率、结构和降血糖活性三个方面,对云南地方药材大苞鞘石斛、铁皮石斛和金钗石斛进行比较。通过热水浸提、透析和层析得到多糖,然后用糖尿病小鼠模型测定降血糖活性。结果表明大苞鞘石斛的多糖得率高(14.1%,DW),且分子量较小,其单糖组成与铁皮石斛多糖相似;降血糖效果强于铁皮石斛和金钗石斛多糖。大苞鞘石斛可作优良的亲本,为降血糖的石斛多糖资源开发提供育种资源。     

基于PLS分析石斛品质与生态因子的相关性

基于中药材产地适宜性分析地理信息系统(TCM-GIS)平台,获得了采样区域11个生态因子值.应用偏最小二乘回归法(PLS)分析了石斛中的化学成分及其与生态因子的相关性.结果表明: 同种石斛不同产地的化学成分含量差异显著.土壤类型与铁皮石斛中多糖含量呈极显著正相关;年降水量与金钗石斛中石斛碱积累呈极显著正相关;温度是影响鼓槌石斛中毛兰素含量的主要因素.主成分分析表明,浙江是铁皮石斛的最佳产地,贵州是金钗石斛的最佳产地,而云南是鼓槌石斛的最佳产地.
     

基于ITS2和psbA-trnH序列的金钗石斛DNA条形码鉴定研究

石斛药材品种繁多,外观鉴定较困难,为保证药材临床疗效,药材品种溯源是关键。本研究以60份贵州赤水产金钗石斛(包括鱼肚兰,竹叶兰和圆茎兰三种种质,各20份)为研究对象,提取其基因组DNA并作为PCR扩增模板,扩增核糖体ITS2和叶绿体psb A-trn H基因片段,并进行测序和相关分析。结果显示,金钗石斛三种种质核糖体ITS2共有序列相似度达96.69%,两两比较,相似度均为100.0%,长度分别为圆茎兰491 bp、竹叶兰492 bp、鱼肚兰493 pb;3种种质叶绿体psb A-trn H共有序列相似度达87.32%,两两比较,相似度均达99.0%以上,长度分别为圆茎兰465 bp、竹叶兰534 bp、鱼肚兰469 bp。两条基因在种内遗传变异较小,均不能区分金钗石斛三种种质。在中药材DNA条形码鉴定系统中,ITS2可将金钗石斛与其他物种区分开,但psb A-trn H不能,可将二者组合作为贵州赤水产金钗石斛的DNA条形码。     

基于表型性状的金钗石斛种质资源多样性评价*

金钗石斛是我国重要的经济作物,具有药用和观赏价值。对收集的 17个居群的野生金钗石斛植株形态、花、气孔、有效成分含量等表型性状进行统计分析和多样性评价,并进行亲缘关系的系统聚类分析。结果表明,不同居群金钗石斛在表型性状上存在明显差异,种质资源具有丰富的遗传多样性;以变异系数较低的7个表型性状为参数进一步进行系统聚类分析,当欧式距离为10时,金钗石斛居群分成三组,其中海南白沙居群独立成一组,表明岛屿隔离阻碍了基因交流,对金钗石斛的生物多样性的贡献较大,因此岛屿为金钗石斛种质资源的就地保护和遗传资源有效维护提供了重要场所,为金钗石斛种质资源的保护和利用奠定了理论基础。     

金钗石斛内生细菌的组成及多样性分析

采用9种培养基对贵州省的赤水市旺隆镇(P1)、贵阳市贵州师范大学生命科学学院大棚(P2)和金沙县台金生态农业观光园(P3)内栽培的金钗石斛(Dendrobium nobile Lindl.)根、茎和叶中的内生细菌进行了分离,并采用扩增核糖体DNA限制性分析(ARDRA)法对分离的内生细菌进行了多样性分析。结果表明:从3个样地金钗石斛的根、茎和叶中共分离出1 081株内生细菌,隶属2门5科12属40种1亚种,可分成41个OTUs;其中,芽孢杆菌属(Bacillus)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)为优势属,Bacillus subtilis subsp.subtilis和Brevibacillus invocatus为优势种(亚种)。金钗石斛的内生细菌在不同器官中的分布存在差异,根中内生细菌的菌株数量最多(695),且根中内生细菌的Shannon-Wiener多样性指数(2.20)和Margalef丰富度指数(5.81)均高于茎和叶中内生细菌,而叶中内生细菌的Pielou均匀度指数却最高(0.69);并且,茎和叶间内生细菌的Sorenson相似性系数最高(0.82),显著高于根和茎间以及根和叶间内生细菌的Sorenson相似性系数。3个样地金钗石斛内生细菌的共有OTUs有14个,分离菌株数占金钗石斛内生细菌分离菌株总数的96.5%;并且,3个样地金钗石斛内生细菌的Shannon-Wiener多样性指数和Pielou均匀度指数差异较小,仅P1样地金钗石斛内生细菌的Margalef丰富度指数明显高于P2和P3样地。NA、TSA、LB、KB、R2A和TB培养基从金钗石斛中分离出的内生细菌菌落数和OTU数量均高于YPD、YT和YG培养基。研究结果显示:金钗石斛体内含有丰富的内生细菌资源,并且,其内生细菌的组成和多样性与分离器官、种植地和培养基密切相关。     

不同附主树种对金钗石斛生长的影响

金钗石斛(Dendrobium nobile)具有极高的药用价值,是重要的林下药用植物。在华南地区9种主要人工林树种进行金钗石斛种植试验,通过调查金钗石斛保存率、株高、茎粗与生物量等生长指标,研究不同附主树种和种植高度对金钗石斛存活和生长的影响,为林下栽培金钗石斛提供技术依据。结果表明:不同附主树种和种植高度对金钗石斛生长和生物量积累有显著影响。9个附主树种中,附着于马占相思的金钗石斛生长表现最好,生长18个月生物量对比附着于南洋杉增加了26.3%,南洋杉最不适于金钗石斛生长,台湾相思与马占相思有相似效应,综合评价得分最高的是马占相思(0.77),南洋杉得分最低(0.44);最佳附树种植高度为树干中部(距地面1.2~1.5 m),平均单株干重高于下部(距地面0.6~0.9 m)4.7%,高于上部(距地面1.8~2.1 m)9.8%。因而,在华南地区人工林种植金钗石斛,马占相思林分树干中部位置是其理想生境。     

诱导子CuSO4对金钗石斛原球茎产石斛碱的影响

为了探究在金钗石斛原球茎培养过程中,添加诱导子CuSO₄对其石斛碱产量的影响,并获得原球茎产石斛碱的优化条件,为后续多因素胁迫金钗石斛原球茎高产石斛碱提供数据支撑。采用液体悬浮培养的方式,研究了诱导子CuSO₄在不同添加时间、不同浓度、添加后不同培养时间3种处理因素对金钗石斛原球茎生物量和产石斛碱的影响。结果表明:添加0.25 mmol/L CuSO₄培养10～20 d,对原球茎的抑制作用强于培养30～40 d,其中培养20 d为最佳添加时间,石斛碱含量最高达29.65μg/g。CuSO₄浓度为0.25 mmol/L时,石斛碱含量最高达35.10μg/g,原球茎生物量也最多,达2.72 g,增殖系数达到了0.36;随着CuSO₄浓度的增加,经不同处理的原球茎抑制程度逐渐增加,原球茎也出现褐化死亡。添加诱导子后培养时间处理因素对原球茎的影响不明显,当培养至20 d时,石斛碱含量最高达29.37μg/g。最优的CuSO₄胁迫条件:在原球茎培养20 d时,加入浓...     

七种石斛花朵挥发性成分分析

为了解几种石斛属植物鲜花挥发性成分,该文利用固相微萃取(SPME)法结合GC-MS技术分析了7种石斛(含2个品种)花朵挥发性成分及其相对含量。结果表明:(1)从7种石斛(含2个品种)中共鉴定出52种挥发性化合物,包括萜烯类、酯类、芳香族化合物、含氮化合物、烷烃类、醇类和酮类等7类,其中萜烯类总相对含量最高,为83.25%～94.93%,为主要挥发性成分。(2) 7种石斛共同含有(1R)-(+)-α-蒎烯、D-柠檬烯和顺式-β-罗勒烯等3种成分,每个品种的相对含量存在差异。其中,顺式-β-罗勒烯在鼓槌石斛、细叶石斛、流苏石斛、翅梗石斛和春石斛‘H1’等5种石斛中的含量均最高,分别达到46.09%、46.40%、39.02%、65.96%和54.34%;(1R)-(+)-α-蒎烯在鼓槌石斛、流苏石斛、翅梗石斛、春石斛‘H1’和春石斛‘818’等5种石斛中的相对含量相对较高,分别为34.11%、25.61%、15.26%、21.11%和23.21%; D-柠檬烯在翅萼石斛和翅梗石斛中的含量较高,分别为16.02%和6.86%,而在其他5种石斛中的含量均较低。(3)β-蒎烯在流苏石斛和翅萼石斛中的相对含量高达19.39%和45.95%,桧烯仅在春石斛‘818’中能检测到(12.24%)。这些含量较高的成分可能为主要的香气成分或特征性香气成分。综上结果认为,7种石斛花朵挥发性成分既含有相同的成分也含有不同成分,且含量随种类的不同而不同。这些结果可为研究石斛属植物花香代谢以及产品开发等提供参考价值。     

金钗石斛焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因的克隆及表达分析

焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶(pyrophospomevalonate decarboxylase,MVD)是甲羟戊酸途径中的关键酶,在植物细胞萜类物质合成代谢过程中发挥着重要的作用。石斛碱作为倍半萜类生物碱,其合成很可能离不开MVD的参与。本研究利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,首次从金钗石斛中克隆到一个MVD基因,命名为Dn MVD(Gen Bank注册号KY626328)。Dn MVD基因c DNA全长1 763 bp,编码一条由424个氨基酸组成的多肽,分子量为47.132 63 k D,等电点6.84。Dn MVD编码的蛋白包含GHMP激酶超家族的特异性识别序列,且拥有严格保守的1个亮氨酸、1个天冬氨酸和3个半胱氨酸活性位点,与多种植物MVD高度同源。Dn MVD的表达受到菌根真菌的影响,金钗石斛茎中Dn MVD的表达量于接菌后期显著高于对照。Dn MVD基因的分子鉴定及其在接菌前后金钗石斛茎中的表达特性为进一步解析该基因在金钗石斛石斛碱合成代谢途径及菌根互作过程中的分子调控作用奠定了重要的基础。     

拟境栽培下两种附生方式金钗石斛化学组成和根内生菌比较及相关性研究

研究拟境栽培下附石(stone epiphytic cultivation, SE)和附木(tree epiphytic cultivation, TE)两种附生方式金钗石斛化学成分组成和根内生菌的差异性及二者的相关性。采用高通量测序技术对根内生菌进行了测序与分析,并初步探究了化学成分含量与根内生菌的差异性和相关性。研究结果表明,SE金钗石斛中石斛碱、总生物碱、总黄酮含量高于TE,TE总多糖含量高于SE。两种附生方式金钗石斛根内生菌物种相对丰度差异较大,SE金钗石斛根内生菌物种丰富性、多样性高于TE,SE中的壳三毛孢属(Robillarda)促生菌、根瘤杆菌属(Rhizobacter)和芽孢杆菌属(Bacillus)固氮菌、镰刀菌属(Fusarium)致病菌属较TE增加,而TE中的柱孢属(Cylindrocarpon)和Ralstonia致病菌属较SE增加。相关性研究发现,SE金钗石斛富集的假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、根瘤杆菌属(Rhizobacter)细菌相对丰度与石斛碱含量显著正相关;TE富集的Cladophialophora真菌、热酸菌属(Acidothermu...     

4种石斛属植物花朵挥发性成分分析

为了解石斛属植物花朵中的挥发性成分, 利用固相微萃取(SPME)方法结合GC-MS 技术测定了鼓槌石斛、罗河石斛、细叶石斛和密花石斛盛花期的花朵挥发性成分及其相对含量。结果表明, 从4 种石斛属植物花朵中共鉴定出挥发性成分57 种, 包括酯类、萜烯类、醇类、烷类、醛类、酮类、醌类、芳香族和含氮化合物。4 种石斛花朵挥发性成分的组成和含量差异明显。鼓槌石斛和细叶石斛的主要香气成分是3-蒈烯, 相对含量分别为84.606% 和71.251%。罗河石斛挥发性成分中水杨酸甲酯相对含量最高(57.449%), 其次为D-柠檬烯(22.416%)。密花石斛花朵主要挥发性成分是2-亚甲基-4,8,8-三甲基-4-乙烯基-双环[5.2.0]壬烷(82.013%), 其次为α-法尼烯(4.699%)。这些对于香型石斛兰品种的培育和兰花精油产品开发提供了参考。     

基于UPLC-Q-TOF-MS技术的玫瑰石斛生物碱研究

玫瑰石斛(Dendrobium crepidatum)是兰科石斛属多年生附生草本植物,具有较高保健和药用价值。本研究利用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF-MS)技术,研究了玫瑰石斛茎中生物碱成分和相对含量。从玫瑰石斛茎中共鉴定出15种成分:相对含量大于50μg/g的成分有两种,玫瑰石斛胺174.844μg/g,玫瑰石斛啶碱92.862μg/g;含量介于5～50μg/g间的成分有玫瑰石斛碱B、玫瑰石斛碱D、玫瑰石斛碱、玫瑰石斛碱C、玫瑰啶碱B;含量低于5μg/g的成分有玫瑰石斛素、N-异戊烯基石斛碱、石斛碱、N-异戊烯基石斛星碱、杓唇石斛素、玫瑰石斛碱E、玫瑰酚A、石斛酮碱。该研究首次在玫瑰石斛中发现4种倍半萜类生物碱。玫瑰石斛生物碱以八氢中氮茚类生物碱为主。     

菌根真菌促进金钗石斛的生长及氮利用

菌根在兰科的生命周期和进化史上起着关键作用。兰科中大多数是附生兰,但它们的菌根研究相对缺乏。为了探讨菌根对附生兰的影响,本研究用金钗石斛（Dendrobium nobile）与通过形态学特征和分子生物学鉴定的分属于瘤菌根菌属（Epulorhiza）的s1和胶膜菌属（Tulasnella）的S3真菌共培养。共培养结果表明,S1和S3与金钗石斛形成了共生关系,且不同程度地促进了其生长。15N稳定同位素标记实验证实,S1菌株显著促进了金钗石斛对有机氮的利用,而S3菌株没有显著的促进作用。同时．S1和S3真菌均能提高金钗石斛中石斛碱的含量。研究结果表明,菌根真菌能促进附生兰幼苗的生长、有机氮的利用和次生代射产物的积累。     

金钗石斛养胃保健口服液的工艺优化及功效学分析

为优化金钗石斛养胃保健口服液制备工艺,并初步探索口服液对胃粘膜的保护作用,本研究以口服液中多糖、党参炔苷、石斛碱的相对含量作为考察指标,通过单因素考察及正交设计法优化口服液的制备工艺,采用急性胃粘膜损伤酒精模型对金钗石斛养胃保健口服液进行功效学研究。结果显示,金钗石斛养胃保健口服液的配方为金钗石斛8 g、党参32 g、黄芪32 g、白术12 g、麦冬10 g、北沙参10 g、山楂10 g,可修复胃粘膜损伤。正交设计优化口服液的制备工艺结果为:加水量为15倍,提取时间为30 min,提取次数为3次。由此得出结论,优化后的口服液制备工艺可行、可靠;通过药效学实验,证明选定的配方具有明显的胃粘膜保护作用。本研究将得出金钗石斛养胃保健口服液的最优化制备工艺,并能确定口服液保护胃粘膜的功效。