通气培养法生产无毒炭疽芽孢苗

1973年兰州兽医生物药品厂采用2%蛋白胨作培养基,用通气培养方法,可获得3.4亿—9亿/毫升芽孢的芽孢液。这是无毒炭疽芽孢苗生产的重大改革。我厂在研究通气培养法生产无毒炭疽芽孢苗的过程中,对无毒炭疽芽孢生长发育情况进行了探索,并对     

改良炭疽菌苗开发中克隆的保护性效力和进展

<正>以往的研究致力于开发更安全、有效的人用炭疽菌苗,已经证明无论化学菌苗或活菌苗必须含有一种或几种毒素成份方可保护活芽胞攻击。我们近期的研究致力于∶畜苗炭疽杆菌Sterne株Aro_突变株,产保护性抗原(PA)的重组活菌苗,和含PA,PA片段和新佐剂配方的非活菌苗。 炭疽杆菌Aro—1和Aro—2 用四环素抗性转座子Tn916致突变,使炭疽杆菌链霉素抗体、产毒素、无荚膜株UM23—1产生两个独立的Aro~-突变株,此二株Aro~-突变株的生长需要几种芳香族复合物,命名为Aro—1、Aro~-—2,它们对小鼠和豚鼠比UM23—1株毒力弱,但用其免疫小鼠和豚鼠,对强毒炭疽杆菌芽胞致死量非肠道攻击提供明显保护。当体外无四环素培养时,两种Aro~-突变株回变到亲本表型。     

涡虫神经纤维的硫酸铜-硝酸银显示法

整体染色:(1)在10毫升福末林(普通的);45毫升95％乙醇;2毫升冰醋酸組成的混合剂內固定24—48小时。(2)不用洗滌,轉入70％乙醇內3—10天。(3)在蒸餾水內洗滌一小时。(4)在50℃下,在10％硫酸銅(CuSO_4·5H_2O)內浸3小时。(5)不經洗滌,在50℃下,轉入1％硝酸銀內1.0—1.5小时。(6)在蒸餾水內洗3分钟,連續三次,每次一分钟。(7)在40—45℃时水浴內,在下述显影剂內还原,显影剂配法:1％連苯三酚10毫升;56％乙醇(一般为60％)     

大瓶旋转培养地鼠肾细胞用于流行性乙型脑炎疫苗生产

地鼠肾组织经胰酶消化后,接种于盛有2000毫升含5％小牛血清的营养液的15升大瓶内,在旋转机上(4—5转／小时)37--38℃培养42—48小时,瓶壁周围即布满繁殖成致密单层的细胞。然后接种乙型脑炎病毒“P,”毒种,37—38℃静置培养36—48小时。当25—50％细胞圆缩,病变区明显和较多细胞脱落时收获,毒力log LD50 为5.0—6.5者占74％;log LD50为4.5一4.9者占26％。所制疫苗的ID50=10-3叫毫升以下者占84．6％。疫苗在8屯保存一年半,ID50没有降低。     

一株产碱性蛋白酶菌株的选育及其发酵条件的研究

从土壤中分离到的553株芽孢杆菌中选出一株产蛋白酶活力较高菌株,经紫外线和亚硝基胍诱变,获得一株产碱性蛋白酶的菌株,酶活力可达10000u／m1,此菌株经鉴定为地衣状芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。适宜的发酵条件：培养基由6％玉米粉(山芋粉或葡萄糖),4％豆饼粉(或其水解液),Na,HP0．·12Hz0 0．4％,KH：P0·0．03％,Na zc0,0．1％组成,pH7．O,37℃旋转摇床振荡培养{2一q6小时。酶作用的最适条件：60℃,pH9．0一10．5,在pH6．0—10．5范围内稳定。酶受DFP抑制。     

枯草芽孢杆菌产β-甘露聚糖酶固体发酵条件的优化

芽孢杆菌是产甘露聚糖酶的优良菌株,首次研究芽孢杆菌固体发酵条件的优化。以天然麸皮作为基本原料,研究利用枯草芽孢杆菌WY34固体发酵生产β-片露聚糖酶的发酵条件。最佳固体发酵培养条件为：麸皮5g,初始水分含量71％,初始pH7．0,接种量为2mL,1％Tween-80,0.4g魔芋粉,培养温度50℃。在最适条件下培养5d,甘露聚糖酶酶活高达7,650U／g干基,是未优化前酶活的2．78倍。     

卫氏并殖吸虫童虫回收和体外保存的实验研究

将实验感染卫氏并殖吸虫囊蚴的21只小鼠和25只大鼠的组织碎片,分别浸于37℃林格氏液中,不同时间内共检获游离的童虫3026条,其中93.6％及98.5％以上的童虫是于浸泡2及4小时检获的,提示此法浸泡2—4小时即可回收绝大多数的虫体。对检获的活虫保存在4—8℃的灭菌生理盐水,林格氏液或囊蚴保存液中,至少可活5天,个别童虫在囊蚴保存液中可活39天以上,而同液保存在20—25℃或37℃中,1—2天即有童虫死亡,5—10天全部死尽。     

乳酸菌D—80葡萄糖异构酶的研究

采用乳酸菌D-80为试验用菌种,经试验找出了适合产葡萄糖异构酶的培养条件。培养基含有：玉米芯水解液还原物1．2—1．4％,米糠饼2一4％,麸皮0.2～0.4％(二者经1398蛋白酶水解)及MnSO．0.05％。微量通风,开罐发酵,35—37℃培养。培养前期6—7小时,用NaoH调节发酵液pH为4．9—5．1。总的发酵时间为10一14小时。成熟醪中的菌体,经分离后,加入30—40％的葡萄糖浆,pH 6．4—6．7,MnSO4的含量10-4M,60—65℃的条件下转化,果糖的转化率为40％左右。经扩大试验后,进行技术鉴定,认为工艺路线基本上是合理的,经济上也是合算的,可进一步扩大试生产。     

炭疽疫苗免疫小鼠外周血TH2，TH1和浆细胞免疫应答动态观察

为了深入了解炭疽两种疫苗——A16R芽孢苗与炭疽无菌培养滤液佐剂吸附苗（anthrax vaccine adsorbed,AVA苗）诱导小鼠免疫应答类型的差异,筛选疫苗免疫评价有效的免疫学参数,分别从抗体及细胞应答水平上对炭疽两种疫苗免疫Balb／C小鼠后免疫应答产生过程进行了动态观察．抗体检测结果分析显示,A16R芽孢苗免疫小鼠血清中可同时检测到抗芽孢抗体与抗AVA抗体,AVA免疫可诱导小鼠产生高效价的抗AVA抗体;两种疫苗免疫小鼠血清IgG抗体亚型均以kG1和IgG2b为主,A16R免疫组IgG2a明显高于AvA免疫组．细胞应答结果分析显示,两种疫苗免疫外周血中均可检测到抗原特异性的TH2,TH1和浆细胞应答．TH2应答于免疫后5天即可在外周血中检测到,至观察末期仍可维持在较高水平;TH1应答,A16R免疫组出现早于AVA免疫组,免疫后5天即可检测到,AVA免疫组于二次免疫的7天才出现,观察末期两组均可检测到低水平的TH1应答;两种疫苗免疫小鼠外周血中均可检测到抗原特异性的浆细胞,A16R免疫组出现早,维持时间长,至观察末期仍呈现上升趋势,AVA免疫组,浆细胞出现较晚,维持时间较短,观察末期仅检测到低水平的浆细胞．上述结果表明,多抗原刺激物的A16R芽孢苗较AVA能更有效的诱导细胞免疫应答;炭疽疫苗免疫后小鼠外周血中TH2,TH1和浆细胞细胞应答,可以同抗体一起,作为疫苗有效性的免疫评价指标．     

流行性乙型脑炎减毒活疫苗（SA14—14—2）对免疫抑制剂处理小白鼠的致病性和免疫原性

免疫抑制剂环磷酰胺处理的12－14克三周龄小白鼠免疫功能抑制后,皮下注射乙脑SA14－14－2减毒活疫苗,未见小鼠出现特异性死亡。同时发现对活疫苗和死疫苗的免疫反应明显不同,处理后小鼠对活苗免疫仍有较好的免疫力,保护率为56％（三次抑制）和80％（二次抑制);而死疫苗免疫力明显下降,未抑制组为100％,抑制后九到10－20％。若小白鼠经乙脑活苗、死苗免疫后四周已建立免疫力后,再用环磷酰胺处理,并用强毒株P3攻毒,则对免疫反应影响不明显,两种疫苗均表现有较好的保护作用。     

红内期诺氏疟原虫体外培养的研究

本文报道连续进行诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)体外培养183天的试验。 试验比较了改良Harvard培养液,RPMI 1640培养液和199培养液,我们认为用199培养液为基础培养液,再加入几种生长因素和15％小牛血清,可获得良好结果。该原虫用Trager燃烛法在100毫升三角瓶内装5—6毫升于37℃培养。至少有5批培养均连续进行一个月以上,第一批培养已达l 83天,稀释倍数为5．4×1082。至于另4批,我们认为既已能超过一个月,就可以无限期地连续进行培养,故未继续。培养至6I、120、127和15l天时,取培养物静脉注射健康猴,每 次剂量为十万个已感染疟原虫的细胞,所有动物均显虫血症。除一只猴外均死于感染,存活的猴所注射的是培养1 z0天的样品。当虫血症达11％时,感染逐渐减少,形成低度带血。随后证实,培养127天和151天的疟原虫仍未失去感染性。试验还证明,低温保存的感染血液和新鲜血液同样可用于培养。     

碱性蛋白酶产生菌209的发酵及其酶的基本特性

为了适应皮革工业上酶法脱毛的需要,筛选到一株碱性蛋白酶产生菌209菌株,经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。其产酶的发酵培养基成分是：豆饼粉2．5—3.5％,麸皮3.5一4.5％,NaaHPO4 0.4％,KH2PO4 0.03％,CaCl2 0.3％,Na2CO,0．5％。pH9.0(灭菌后)用50升罐,在35—36℃,通气量1：0.5—1：1,发酵31小时,酶活达到5000单位左右,该酶作用的最适PH是9一11,最适温度(反应20分钟)50℃,延长反应时间在40℃以下为宜,塑料袋贮藏11个月酶活力不变,对小白鼠试验无毒。     

猕猴肝细胞的分离及培养

用浓度为50毫克/100毫升的胶原酶液,在体外无菌的条件下灌注分离猕猴肝组织块,所分离到的肝细胞活性率达88—91％。用含10％胎牛血清,0.2％牛血清白蛋白,1毫升/100毫升牛咦岛素的基础培养基(MEM),在37℃含5％CO_2:的培养箱中培养。细胞在塑料培养皿中贴壁伸展良好,培养一个月后,仍见有大量贴壁的肝细胞,它可满足弓形体的生长发育。     

实验9 λ噬菌体DNA的提取

一、平板扩增抽提法 1.LB培养基上划线接种宿主菌,37℃培养过夜。 2.挑取单菌落接种在LB培养液中,培养液含0.2％麦芽糖。37℃振荡培养过夜。 3.0.5毫升菌液;0.1毫升 Mg~++Ca~++溶液(10mM MgCl_2/10mM CaCl_2);噬菌体[10~5pfu(噬斑生成单位)],混和,37℃水浴中保温15分钟。 4.加入4毫升42—45℃含0.7％琼脂粉的LB培养液,迅速混匀,铺在直径为8.5厘米的含1.5％琼脂粉的LB培养基上。37℃培养过夜。铺有上层培养基的一面朝上培养。     

应用~3H-胸腺嘧啶核苷测定血淋巴细胞转化的方法

本文介绍了应用微量血液测定DNA合成的方法:0.1毫升肝素抗凝血液灌入3毫升含PHA的Fagle’s生长培养液中,培养54小时后注入~3H-TdR 0.6微居里,再培养16小时,吸弃上清液,沉淀用生理盐水洗涤两次,5％三氯醋酸洗一次。然后沉淀加0.5毫升5％三氯醋酸置90℃水浴15分钟,离心后吸取上清液0.2毫升加到5毫升闪烁液中进行测量。闪烁液配方:PPO 3克,POPOP 0.4萘克、110克、二氧六环1000毫升。10例健康人血平均~3H-TdR掺入率为10.8％。     

丁酸梭杆菌发酵甘油制备1,3-丙二醇的研究

本研究采用丁酸梭芽孢杆菌(Clostridium butyricum)从甘油发酵制备1,3—丙二醇。该发酵需厌氧培养,发酵培养基为：甘油6％,葡萄糖1％,玉米浆2％,(NH4)2SO40．2％。发酵温度为34℃,pH为6．5～7。在最佳条件下,发酵50h可产1,3—丙二醇40．7g／L,甘油摩尔转化率达68％。     

从小白鼠血液制备染色体的快速方法

每只小白鼠注射(I.P)0.1毫升秋水仙素(0.6毫升/毫升),四小时后杀死。从心脏取血,用肝素抗凝。取10滴左右血液置于一刻度离心管中,管内预先装好3—5毫升0.7％柠檬酸钠,放在37℃下温浴,摇匀后加一滴稳定的玻璃酸酶(150N.F.单位/毫升)。在37℃下温浴20分钟。用温浴的最后五分钟配制3∶1甲醇-醋酸固定液。温浴完毕时加2滴固定剂并温和地摇匀。600转离心机离心5分钟弃去上清液(留1毫升左右)再加3毫升固定剂,加塞后放置冰箱30分钟。在600转离心机离心5分钟弃去上清液(留1毫升),再加预冷固定液3毫升,用吸管来回搅匀。离心弃去上清液。再加2毫升冷固定剂,并在冰箱中过夜。第二天离心后弃去上清液,用甲醇洗,吸去甲醇,取一     

四联活菌苗气雾免疫研究——Ⅲ.炭疽、布氏、鼠疫、土拉活菌苗联合气雾免疫家兔血清抗体测定及炭疽菌苗的保护力试验

一、炭疽活菌苗单价气雾或与布氏、鼠疫、土拉联合气雾一次吸入免疫均能产生较好的免疫力,每只动物剂量3亿,攻击80个绝对致死量可保护70-100%。二、应用炭疽乳胶抗原测定免疫血清抗体水平,可见动物保护在70-100%时,其血清几何平均滴度为1：12-1：18之间。在四联气雾免疫中,不论是血清抗体的产生还是对强毒菌的攻击,都与单价结果相近,看不出有干扰现象。三、应用炭疽、鼠疫乳胶抗原,布氏、土拉菌体染色抗原测定血清抗体,结果表明上述四种菌苗免疫后六天半数以上动物产生抗体,十二天内可达100%阳转。四、用炭疽、鼠疫乳胶抗原在免疫前测定动物自然抗体,全部为阴性,免疫后血清滴度达到1：5者,玻片全血凝集即为阳性。玻政策全血凝集具有特民、敏感、简易、快速等特点,可作为炭疽、鼠疫活菌苗免疫后效果观察的辅助方法。     

大肠杆菌(Escherichia coli A S 1.357)L-天门冬酰胺酶的研究I. L-天门冬酰胺酶高产菌株的筛选

从87株细菌中筛选取得L-天门冬酰胺酶的高产菌株大肠杆菌(Escherichia coli AS 1.357)。采用7.5—10％玉米浆培养基(pH7.0一7.5),于37℃振荡培养8小时,可获得高活力的L一天门冬酰胺酶(4．6单位／毫升)。在我们的实验条件下,葡萄糖不利于L-天门酰胺酶的形成．     

抗炭疽人源化单抗在炭疽芽孢致死小鼠模型中的治疗效力评价

目的:建立炭疽芽孢(疫苗株A16R)攻击DBA/2J小鼠的致死模型,并使用该模型评价抗炭疽人源化单抗5E11的治疗效力。方法:用不同剂量A16R芽孢背部皮下攻击小鼠,计算半数致死剂量(LD_(50));ELISA定量检测5E11在小鼠体内的药代动力学参数;用100倍LD_(50)的芽孢攻击小鼠,攻毒后不同时间用不同剂量的5E11单抗治疗小鼠,观察小鼠存活等情况。结果:A16R芽孢攻击DBA/2J小鼠的LD50为7.8×10～3CFU;5E11在小鼠体内的平均消除半衰期约为7 d;攻毒后1 d给药的几个剂量组能够完全保护,攻毒后2～3 d给药能够提供40%～80%的保护。结论:抗炭疽人源化单抗5E11在芽孢攻击致死小鼠模型中表现出良好的保护效果,具有紧急治疗炭疽芽孢感染导致的急性炭疽的潜力。