大黄鱼TRIM25基因克隆和表达分析

三重基序蛋白25 (Tripartite motif-containing protein 25, TRIM25)属于E3泛素连接酶家族, 在先天免疫反应中发挥重要作用。为研究TRIM25基因在大黄鱼(Larimichthys crocea)先天抗病毒免疫反应中的作用, 研究鉴定并克隆大黄鱼TRIM25基因(命名为LcTRIM25)。LcTRIM25基因编码序列2097 bp (GenBank登录号: MK327541), 编码698个氨基酸。蛋白结构域预测发现LcTRIM25包括保守的RING结构域、B-box2结构域、Coiled-coil结构域和可变的C末端PRY/SPRY结构域。多序列比对以及系统进化树分析表明LcTRIM25基因与斜带石斑鱼同源性高, 与哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鸟类同源性相对低, 这说明不同物种受到来自环境不同的选择压力, 导致进化程度不同。应用实时荧光定量PCR方法分析大黄鱼TRIM25基因的表达水平。结果分析发现LcTRIM25基因在健康大黄鱼的9个组织中均有广泛表达, 且在肝脏中表达量最高, 在心脏中表达量最低。在poly(I:C)刺激后, 在外周血、头肾、脾脏和肝脏中LcTRIM25基因表达量迅速且明显上调, 均出现上升达到峰值后下降的趋势。LcTRIM25基因表达量在头肾和脾脏中6h达到最高表达量, 在肝脏中12h达到峰值, 外周血中在24h达到最高表达量。上述结果表明, 不同组织中LcTRIM25基因表达模式具有差异性。研究结果推测大黄鱼TRIM25基因参与抗病毒免疫反应且发挥十分关键的作用, 为进一步了解大黄鱼抗病毒免疫机制提供理论基础。     

TRIM25在抗病毒天然免疫及恶性肿瘤发生发展中作用的研究进展

三基序蛋白25 (tripartite motif 25, TRIM25)是一种E3泛素连接酶,其介导的维甲酸诱导基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene I, RIG-I)泛素化是启动细胞内抗病毒反应的重要步骤。近期研究发现,TRIM25还能通过其他途径调节宿主抗病毒能力,包括RIG-Ⅰ的负调节、黑色素瘤分化相关基因5 (melanoma differentiation-associated gene 5, MDA5)的激活、增强锌指抗病毒蛋白(zinc-finger antiviral protein, ZAP)活性、抑制病毒RNA合成。与此同时,病毒与宿主能通过多种机制调节TRIM25,包括泛素化降解、与细胞和病毒RNA结合、与RIG-Ⅰ的结合、竞争TRIM25作用底物。TRIM25在肺癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌、结直肠癌等恶性肿瘤的发生发展中也发挥重要作用。为了更好地了解TRIM25在抗病毒天然免疫与肿瘤发生发展中的作用及其机制,现对近年TRIM25在这两方面的研究进展进行总结。     

猪T细胞受体γ链基因的克隆及生物信息学分析

目的:克隆猪T细胞受体γ链(pTCR-γ)基因,用以研究猪T细胞受体分子结构与功能。方法与结果:以GenBank上登载的pTCR-γ基因为参考序列,用RT-PCR法从猪外周血淋巴细胞中克隆pTCR-γ基因。序列分析表明,pTCR-γ基因开放读框为1026bp,编码341个氨基酸残基,含有由23个氨基酸残基构成的信号肽序列;与参考序列相比,在核苷酸和推导氨基酸序列上的同源性分别为95.6%和88.8%;系统进化分析发现,该基因与绵羊、恒河猴、人、马、牛的同源性相对较高,与褐鼠、家犬、家鼠、家猫的同源性次之,而与禽类、鱼类的同源性最低;生物信息学结构预测表明猪T细胞受体γ链含2个结构域,其中1个为IG_LIKE1结构域(IGv结构域),由第14～114位共101个氨基酸残基组成;另一个为IG_LIKE2结构域(IGc结构域),由第143～238位共96个氨基酸残基组成。结论:克隆并应用生物信息学技术分析了猪T细胞受体γ链基因序列及编码蛋白的结构特征,为进一步研究γ链的结构与功能奠定了基础。     

我国部分鸡源H9N2亚型流感病毒NS1基因序列分析

对1996年至2001年间自我国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的8株H9N2亚型禽流感病毒的非结构蛋白基因(NS1)进行了扩增和序列测定,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性。结果表明, NS1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为96.5%～99.5% 和94.5～98.6%, 说明NS1基因在遗传进化上高度保守,稳定遗传。与中国香港、韩国、巴基斯坦及人源H9N2分离株相比较,发现中国大陆的鸡源H9N2分离株的NS1基因在其羧基端缺少13个氨基酸。系统进化树分析表明,该8株病毒的NS1基因属于相同的进化分支,而且中国的早年分离株A/chicken/Beijing/1/94位于该进化分支的根部,暗示这些分离株的NS1基因是由A/chicken/Beijing/1/94演化而来;尚未发现NS1基因属于A/quail/Hong Kong/G1/97like分支的分离株。同时,系统进化树也说明了我国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化分支,H9N2亚型禽流感的发生和流行与地域有一定的相关性。     

巨大芽孢杆菌分子伴侣GroES和GroEL新基因的克隆及同源性分析

巨大芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌的一种,是良好的重组蛋白的表达宿主.本研究利用PCR技术从巨大芽孢杆菌基因组克隆出一条1.9Kb的基因片段.核酸序列分析结果表明,该片段全长1984bp,包含2个ORF,分别与芽孢杆菌来源的GroES和GroEL基因有高度的相似性.氨基酸序列比对发现,GroES蛋白与枯草芽孢杆菌来源的GroES蛋白氨基酸序列同源性为91%,GroEL蛋白氨基酸序列同源性为90%.     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS1基因的克隆及其序列分析

目的：克隆H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并分析其序列特性。方法：通过RT-PCR方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并对该基因片段进行测序,将此序列与数据库中不同时间、地点、宿主来源的H5N1亚型流感毒株NS1基因序列进行同源性比较。结果：获得了678bp的NS1全长基因,可编码225个氨基酸;其与毒株A／chicken／Jilin／hq／2003的同源性最高,二者的核酸和氨基酸的同源性分别为99．7％和99．1％。比对分析发现,该毒株NS1基因在第238-252位有15个核苷酸的缺失;进化树分析表明,它与1997年香港流行的H5N1亚型禽流感病毒毒株分别属于2个不同的分支。结论：克隆了一株H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并初步分析了其序列特性,为进一步研究NS1基因的功能奠定了基础。     

鸡源H9N2亚型流行性感冒病毒神经氨酸酶基因序列分析

对1996～2001年间自中国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的8株H9N2亚型禽流感病毒的神经氨酸酶基因(NA),进行了扩增和序列测定,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性.结果表明,NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.1%～99.8%和95.7%～99.7%,说明NA基因稳定遗传,高度保守.与A/chicken/HongKong/G9/97相比较,发现中国大陆鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶蛋白在其茎部的第63、64、65位点上都有3个氨基酸的丢失,而与中国邻近的韩国、巴基斯坦鸡源H9N2分离株的神经氨酸酶没有氨基酸的丢失,因此这些部位的氨基酸丢失可初步认为是中国大陆H9N2流感病毒分离株的一个标记.系统进化树分析表明,该8株病毒的NA基因属于相同的进化分支,即A/duck/HongKong/Y280/97-like分支,尚未发现NA基因属于A/quail/HongKong/G1/97-like分支的分离株.中国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化亚分支,说明H9N2亚型禽流感的发生与流行和地域有一定的相关性.     

砂梨CONSTANS基因的克隆及原核表达分析

为了探索梨树植物的开花调控机制,本研究以砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)叶片为材料,采用同源序列克隆法,进行了开花调控相关基因CONSTANS的克隆,命名为PyCO,GenBank登录号为KF246572。序列分析表明,该基因包含一个1023 bp的开放阅读框,编码340个氨基酸,推测蛋白质分子量为37.81 kD,等电点为5.95。PyCO蛋白具有典型的植物CO家族的结构特征,含有2个高度保守的B-box及CCT结构域。进化树分析表明,该氨基酸序列与苹果的同源性接近93%,与碧桃、可可树、草莓等其他高等植物的CO类蛋白同源性也在70%以上。原核表达获得了具有较高表达水平的融合蛋白,分子量约为58.5 kD,为进一步探索梨树开花调控机理奠定了基础。     

代谢在宿主抗病毒天然免疫的重要作用

抗病毒天然免疫是宿主抗病毒感染的第一道防线。研究证明,病毒感染时,几乎所有细胞都能诱导I型干扰素(IFN-I)及其下游的干扰素刺激基因(ISG)的表达,进而介导宿主的抗病毒天然免疫。最新研究发现,细胞组分,尤其是脂质代谢几乎可以促进病毒复制周期的所有阶段,包括病毒与宿主细胞的初始相互作用、囊膜与细胞膜融合、病毒组装和出芽等。这些阶段均是宿主抗病毒天然免疫的作用靶点,也是预防和治疗病毒感染的有效途径。因此,细胞代谢(尤其是脂代谢)在病毒感染诱导的天然免疫中必定发挥极为关键的作用。代谢在抗病毒天然免疫中作用的研究,必将为预防和治疗病毒感染新途径和新方法的开发提供新的思路。综述将重点探讨代谢在线粒体、过氧化物酶体和少数ISG参与的抗病毒天然免疫中的作用。     

新城疫分离毒HN蛋白的抗原性初步分析及分子特性研究

运用针对NDV囊膜糖蛋白(HN)的单克隆抗体(MAbs),对2005～2006年间自我国江苏和广西部分地区的20株NDV分离株进行排谱试验,初步分析了不同毒株之间HN蛋白的抗原表位差异;并应用RT-PCR技术成功扩增了其HN基因整个编码区,经克隆、测序最终获得13株鸡源NDV与7株鹅源NDV HN基因的编码区序列,分析测定核苷酸序列及推导的氨基酸序列,并将鹅源NDV与鸡源NDV相应序列进行了比较.结果单抗排谱试验表明,20株NDV分离株之间HN蛋白的抗原表位存在差异;测序结果表明,测定的HN基因的编码区长度皆为1716nt编码571个氨基酸;分离株中18株基因Ⅶ型NDV分离株之间HN基因编码区核苷酸序列具有较高的同源性,达94.8%～100%;与近几年国内流行的其它基因Ⅶ型NDV之间的核苷酸序列同源性为92.1%～99.6%.对其推导的HN蛋白一级结构中潜在的糖基化位点及HN蛋白细胞受体结合相关区域的氨基酸序列等进行了比较分析.结果显示,单抗排谱差异显著株在部分氨基酸位点发生了突变;同时揭示我国部分地区同期流行的鹅源NDV与鸡源NDV HN基因之间具有较近的亲缘关系.     

中国西藏小反刍兽疫病毒野生株China/Tib/Gej/07-30基质蛋白基因和融合蛋白基因的分子特征分析

对我国西藏小反刍兽疫病毒野生株China/Tib/Gej/07-30进行基质蛋白(M)和融合蛋白(F)基因序列测定,并进行分子生物学特征分析。首先应用逆转录聚合酶链式反应扩增出M和F基因片段,对聚合酶链式反应产物进行直接测序,然后对测定的核苷酸和推测的氨基酸序列进行比较分析。China/Tib/Gej/07-30的M基因由1483个核苷酸组成,编码335个氨基酸,与其他分离株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为92.4%～97.7%和97.0%～98.2%。F基因由2411个核苷酸组成,编码546个氨基酸,与其他分离株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为85.5%～96.1%和94.3%～98.2%。China/Tib/Gej/07-30的F蛋白含有信号肽序列和跨膜结构域,序列高度变异。F蛋白第104～108位和第109～133位氨基酸位点分别是高度保守的裂解位点和融合肽结构域。F蛋白还含有序列高度保守的三个七肽重复区。China/Tib/Gej/07-30的M基因3′端的非编码区(UTR)长度为443个核苷酸,GC含量高达68.4%,与其他PPRV毒株的同源性为82.4%～93.5%。China/Tib/Gej/07-30的F基因5′UTR区长度为634个核苷酸,GC含量高达70.0%,与其他PPRV毒株序列相似性为76.2%～91.7%。     

巨大芽孢杆菌分子伴侣GroES和GroEL新基因的克隆及同源性分析

巨大芽孢杆菌作为革兰氏阳性细菌的一种,是良好的重组蛋白的表达宿主.本研究利用PCR技术从巨大芽孢杆菌基因组克隆出一条1.9 Kb的基因片段.核酸序列分析结果表明,该片段全长1 984 bp,包含2个ORF,分别与芽孢杆菌来源的GroES和GroEL基因有高度的相似性.氨基酸序列比对发现,GroES蛋白与枯草芽孢杆菌来源的GroES蛋白氨基酸序列同源性为91%,GroEL蛋白氨基酸序列同源性为90%.     

略阳乌鸡抗病毒蛋白基因Mx多态性研究

鸡抗病毒蛋白Mx(myxovirus resistance protein)具有抵抗流感病毒等多种病毒感染的能力。Mx蛋白631位氨基酸决定其抗病毒活性。为了揭示地方特色品种略阳乌鸡Mx蛋白631位氨基酸多态性和抗病毒能力,本研究采用PCR特异性扩增Mx基因,通过引物3'末端区分编码631位氨基酸密码子的A/G多态位点,测序PCR产物鉴定Mx基因多态位点。结果显示,138只略阳乌鸡的抗病毒蛋白Mx编码基因有AA、AG和GG三种基因型,其中病毒强抗性AA型公鸡6只,母鸡15只,共21只,比例为15.2%;敏感性GG型34只,比例24.6%,其中10只公鸡和24只母鸡;杂合AG型83只,公鸡31只,母鸡52只,比例高达60.1%。研究结果解析了略阳乌鸡Mx基因多态性,从DNA水平阐释了略阳乌鸡抗病毒能力低的原因,为后续培育强抗病毒能力的乌鸡个体和种质资源保存提供参考。     

蛋鸡J亚群白血病病毒的分离鉴定及序列分析

通过接种鸡胚成纤维细胞((CEF)及特异性单抗的间接荧光抗体反应(IFA),从中国商品代蛋鸡群中首次分离到J亚群白血病病毒(ALV-J).对其env基因编码的氨基酸序列及3'-末端(3'-Ter)序列与国内外来源于白羽肉鸡的毒株作了比较分析.结果显示,这两株病毒的gp85基因编码的氨基酸序列与国外5个毒株同源性仅为83.4%～87.3%,与国内来源于白羽肉鸡的8株病毒同源性也仅为86.4%～89.6%.gp37基因编码的氨基酸序列与5个国外毒株同源性为91.8%～97.0%,与8个国内毒株同源性为93.9%～95.9%.另外,国内来源于白羽肉鸡的各毒株的3'-Ter序列在"E"区均有明显缺失,但本次分离的来源于蛋鸡群的毒株在"E"区没有缺失突变.与所列出的13株国内外毒株相比,这两个毒株在3'-Ter的缺失最少,较接近于原型株HPRS-103.显然这两株病毒的来源不同于国内白羽肉鸡.     

罗非鱼无乳链球菌α蛋白基因的克隆、鉴定及分子特性分析

本研究克隆了罗非鱼源无乳链球菌HN0101分离株的α蛋白基因,通过生物信息学对其序列分析结果显示:α蛋白基因的ORF由1341个碱基组成,编码一个长度为446个氨基酸的多肽,N-端具有一个保守的YSIRK信号肽序列和一个AlphaC_N超家族结构域,C-末端含有1个保守Gram_pos_anchor超家族结构域,而在中间具有2个重复的Rib结构域;比较不同来源分离株的α蛋白结构,发现主要区别在于Rib结构域重复数目的不同;同源性及系统进化树分析,发现本株菌的α蛋白与已报道的人源A909和鱼源GD201008-001α蛋白聚为一簇,同源性达100%;罗非鱼源无乳链球菌α蛋白为亲水性蛋白,存在一个跨膜区,有37个潜在的磷酸化位点和1个潜在的N-糖基化位点;二级结构分析发现存在较多的无规则卷曲,推测有12个氨基酸区域可能是B细胞抗原表位;当选择大肠杆菌为表达宿主时,该重组蛋白的溶解度高达100%,亚细胞定位显示该蛋白位于细胞壁上。     

神农架川金丝猴投食群TRIM5 alpha基因的变异及其进化分析

目的:本研究探索神农架大龙潭川金丝猴TRIM5alpha蛋白序列的特征、变异、该基因进化特点以及该基因的遗传多样性,对金丝猴的保护和研究具有重要的意义。方法:从神农架川金丝猴投食群随机选择41个个体,采集毛发并提取基因组DNA,设计引物,对其TRIM5 alpha基因编码序列进行PCR扩增和测序,最后对序列进行比对和分析。结果:在神农架川金丝猴投食群41个个体中,TRIM5alpha基因不存在与Cyp A假基因序列融合的现象。与恒河猴序列不同而与人类相似的是,川金丝猴中没有发现TFP339-341型,而只发现△△Q339-341型。41个个体TRIM5alpha蛋白序列没发现任何非同义突变位点,显示该基因在该种群中具有很低的遗传多样性。编码序列的进化分析表明,Coiled-coil结构域和SPRY结构域在进化中经历了明显的正向选择,Ring结构域和B-box结构域则经历了纯化选择。结论:川金丝猴TRIM5 alpha基因存在很多独特变异位点,且经历了明显的正向选择。对投食群的研究表明该基因编码序列在该种群中多样性很低,这从侧面反映了该总群较低的遗传多样性。针对这种情况,建议在种群复壮的工作中,适当引入一批有效的建群者。     

肠道病毒ECHO25河南分离株基因特征分析

首次对ECHO25病毒进行分子生物学分析,阐明ECHO25(Entric Cytopathic Human Orphanviruses Type25)病毒河南分离株的分子生物学特征及其与世界其它分离株的基因关系。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增出VP1蛋白编码基因并进行序列测定,将所测4株ECHO25病毒的VP1序列与GenBank上已发表的ECH-O25病毒VP1区进行同源性比较及遗传进化分析发现:河南省4株ECHO25与标准株JV-4核苷酸同源性为79.2%～80.1%,氨基酸同源性为89.0%～92.4%;河南省4株ECHO25核苷酸同源性为93.0%～99.0%,氨基酸同源性为92.4%～97.5%;HN-01分离株与HN-26分离株高度同源,其核苷酸同源性达99.0%;河南省4株ECHO25同属B1基因亚型。     

我国四株狂犬病毒M和P基因序列分析和所编码蛋白的分析

为了解我国狂犬病毒M、P基因序列和结构特点,用RT-PCR方法获得目的基因片段,测定核苷酸序列后,计算机分析核苷酸和氨基酸序列及其功能区位点结构。结果显示四株病毒M基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.9%～99.5%和93.1%～99%,四株狂犬病毒M蛋白上调节病毒RNA转录和复制功能的第58位氨基酸残基均为谷氨酰胺残基(E),与特异性细胞蛋白WW区域作用的PPxY结构序列均为PPEY保守序列;四株病毒P基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.6%～99.8%和87.2%～99%,P蛋白与胞浆动力蛋白轻链LC8相互作用的序列位于143～148位氨基酸残基,均为DKSTQT,四株病毒P基因与L蛋白、N蛋白作用位点序列显示未发生影响其生物学功能的变异。研究结果证实了这两种蛋白结构在病毒致病性中起重要作用的推论。     

宿主-病毒在RIG-I信号通路中的相互作用

维甲酸诱导基因-I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)已经被鉴定为RNA病毒感染的细胞传感元件,它与线粒体衔接蛋白MAVS/IPS-1/VISA/Cardif相互作用,诱导I型干扰素(interferon,IFN)介导的宿主抗病毒感染天然免疫.然而,许多病毒已经进化出了种种策略破坏RIG-I介导的信号通路.宿主-病毒的这种相互作用为揭示病毒感染的致病机理和发现开发抗病毒药物的靶标提供了机遇.本文主要综述RIG-I信号通路及不同病毒用来逃避RIG-I信号的策略.     

我国部分鸡源H9N2亚型流感病毒NSl基因序列分析

对1996年至2001年间自我国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的8株H9N2亚型禽流感病毒的非结构蛋白基因(NSl)进行了扩增和序列测定,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性。结果表明：NSI基因核苷酸和氨基酸同源性分别为96．5％-99．5％和94.5-98．6％,说明NSl基因在遗传进化上高度保守,稳定遗传。与中国香港、韩国、巴基斯坦及人源H9N2分离株相比较,发现中国大陆的鸡源H9N2分离株的NSl基因在其羧基端缺少13个氨基酸。系统进化树分析表明,该8株病毒的NSl基因属于相同的进化分支,而且中国的早年分离株A／chicken／Beijing/1／94位于该进化分支的根部,暗示这些分离株的NSl基因是由A/chicken／Beijing/1／94演化而来;尚未发现NSl基因属于A/quail／HongKong／G1／97-1ike分支的分离株。同时,系统进化树也说明了我国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化分支,H9N2亚型禽流感的发生和流行与地域有一定的相关性。