H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白(NS1)基因的克隆与表达

由于H9N2亚型禽流感对我国的养鸡业已造成了很大的损失,因而在我国许多养鸡场不得不使用H9N2亚型禽流感灭活苗[1],但由于灭活苗的使用,而增加了H9N2亚型禽流感的监测难度.因此,建立一种能区别自然感染鸡和疫苗免疫鸡的鉴别诊断方法已被提到日程上来.     

禽流感病毒H5N1亚型NS1基因在大肠杆菌中的表达

目的表达H5N1亚型禽流感病毒(AIV)NS1蛋白,用于AIV感染与注射灭活疫苗鸡的鉴别诊断和NS1蛋白功能研究。方法采用RT_PCR方法对H5N1亚型AIVNS1基因进行扩增,将PCR产物克隆于pGEM_T_easy载体,将该基因插入pGEX_4T_1中构建NS1基因原核表达载体,转化BL21大肠杆菌后,在IPTG诱导下表达NS1蛋白,Westernblot鉴定表达NS1蛋白。结果成功克隆H5N1亚型AIV的NS1基因,其核苷酸序列长度为690bp,编码230个氨基酸残基。构建NS1基因原核表达载体在大肠杆菌内表达出约51×103的NS1融合蛋白。Westernblot鉴定表明表达NS1蛋白与H7N2AIV感染鸡血清有反应性。结论在大肠杆菌中成功表达了H5N1亚型AIVNS1基因蛋白,具有与感染H7N2亚型AIV阳性血清反应原性。     

H9N2亚型禽流感病毒NS1基因的进化分析

利用RT-PCR方法,扩增了1998～2005年间分离的9株H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,对其进行了序列测定和进化分析.序列分析表明,9株AIV NS1基因完整的阅读框均为654bp,编码217个氨基酸,其核苷酸和推导的氨基酸同源性分别为95.4%～99.8%和93.6%～100%;9株病毒的NS1蛋白的C端均有13个氨基酸的缺失;进化分析表明,9株AIV属于A群,且形成一个独立分支,在该分支中,只有Ck/HN/A3/98株属于Ck/HK/Y280/97-like亚类,且与Ck/BJ/8/98的进化关系最近,其余8株属于Ck/SH/F/98-like亚类,说明Ck/SH/F/98-like亚类的H9N2亚型AIV在中国大陆的鸡群中广泛存在.NS1基因的进化及其编码产物的特性分析,为AIV的毒力变异、致病机制、药物靶位点的设计及鉴别诊断的研究奠定了基础.     

禽流感病毒H5N1亚型NS1蛋白的研究进展

NS1蛋白（non—structural protein1）是A型流感病毒重要的非结构蛋白,作为流感病毒的致病因子,NS1通过多种方式增强病毒的致病性和毒力。就H5N1禽流感病毒NS1蛋白的结构与功能进行了综述。     

口蹄疫病毒非结构蛋白3abc基因的克隆与表达

口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)非结构蛋白(NSP)—3ABC可用于注苗与感染动物的鉴别诊断,合成该基因的PCR引物,并在引物5’端和3'端分别加入含BamHⅠ和HindⅢ限制性酶切位点序列。以FMDV毒株基因组RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增3abc基因,得到的基因片段与T载体连接,转化DH5α。提取重组载体pT-3ABC,经BamHⅠ/HindⅢ双酶切后与载体pET32a连接,转化宿主菌BL21(DE3)plysS,IPTG诱导表达目的蛋白。SDS—PAGE及Western Blotting检测和鉴定结果表明,在大肠杆菌中成功表达了NSP—3ABC蛋白,分子量约56kDa,且该表达产物可与FMDV感染的动物血清产生免疫反应。ELISA试验结果显示,表达蛋白可用于FMDV注苗与感染动物的鉴别诊断。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体基因的克隆及表达

构建并表达H5N1亚型禽流感病毒血凝素蛋白单链抗体,为禽流感靶向治疗药物的研制制备靶向载体。从分泌血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA,采用RT-PCR法扩增出重链和轻链可变区基因,通过SOE-PCR法将重链和轻链通过Linker连接起来构建单链抗体基因,将获得的单链抗体基因装入原核表达载体pET28a(+)中,构建重组质粒并表达,以Western blot鉴定单链抗体的特异性。结果成功构建了单链抗体基因,全长714bp,经原核表达,所构建的单链抗体可与H5亚型禽流感病毒HA蛋白特异结合,为禽流感的靶向治疗奠定了基础。     

人H5N1亚型禽流感病毒安徽株NS1基因的克隆及在原核系统的表达

利用RT-PCR方法,从人H5N1亚型禽流感病毒安徽株扩增到了NS1基因,对其进行了克隆、序列测定和分析,并在原核系统高效表达和纯化了NS1蛋白。进化分析表明,A/Anhui/01/2005毒株与近些年国内分离的水禽H5N1病毒进化关系更为接近。NS1与福建、湖南分离的禽流感病毒同源性最高,分别达到99.1%和98.2%。序列分析表明,与病毒的致病性相关的92位氨基酸为Asp,与病毒的细胞因子抗性相关的80~84位氨基酸发生缺失,与断裂/多聚腺苷酸化特异性因子结合的基序改变为GFEWN,和病毒致死性相关的PL基序为ESEV。随后在大肠杆菌高效表达并纯化了NS1蛋白。NS1基因及其编码产物的特性分析以及在原核系统的表达,为进一步研究NS1的致病机制和抗病毒药物研制奠定了基础。     

我国部分鸡源H9N2亚型流感病毒NS1基因序列分析

对1996年至2001年间自我国部分养鸡场发病鸡或死亡鸡分离鉴定的8株H9N2亚型禽流感病毒的非结构蛋白基因(NS1)进行了扩增和序列测定,并分析和比较了其核苷酸和氨基酸的同源性。结果表明, NS1基因核苷酸和氨基酸同源性分别为96.5%～99.5% 和94.5～98.6%, 说明NS1基因在遗传进化上高度保守,稳定遗传。与中国香港、韩国、巴基斯坦及人源H9N2分离株相比较,发现中国大陆的鸡源H9N2分离株的NS1基因在其羧基端缺少13个氨基酸。系统进化树分析表明,该8株病毒的NS1基因属于相同的进化分支,而且中国的早年分离株A/chicken/Beijing/1/94位于该进化分支的根部,暗示这些分离株的NS1基因是由A/chicken/Beijing/1/94演化而来;尚未发现NS1基因属于A/quail/Hong Kong/G1/97like分支的分离株。同时,系统进化树也说明了我国的H9N2分离株与韩国、巴基斯坦等地的H9N2分离株隶属于不同的进化分支,H9N2亚型禽流感的发生和流行与地域有一定的相关性。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因截短体的克隆与原核表达

禽流感病毒H5N1 NS1蛋白是一种非结构蛋白,在病毒感染过程中发挥着重要的作用.构建基因截短的重组蛋白,可为进一步研究NS1不同结构域与宿主蛋白间的相互作用奠定基础.在成功克隆禽流感病毒H5N1全长NS1基因并测序的基础上,将部分截短基因序列克隆到表达栽体pET28a(+)上,构建基因截短的重组表达质粒pET28a-NS1-RBD和pET28a-NS1-ED,转化大肠埃希菌BL21(DE3),阳性重组质粒经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测,获得预期蛋白的表达,然后利用Ni-NTA树脂蛋白纯化系统对重组蛋白进行纯化,并通过Western Blotting进一步确认NS1及截短体蛋白的表达.结果表明,实验成功构建禽流感病毒H5N1亚型的NS1蛋白截短体,并在大肠埃希菌中高效表达,这为进一步研究NS1蛋白不同结构域与宿主蛋白的相互作用提供了实验材料,为深入研究NS1蛋白的生物学功能奠定了坚实基础.     

H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因的克隆与表达

根据已知H5N1亚型禽流感病毒神经氨酸酶基因(na)序列设计、合成克隆引物.自H5N1亚型病毒感染的鸡胚尿囊液中提取总RNA,反转录后采用高可信度DNA聚合酶(PyobestTMDNAPolymerase)扩增na基因,采用Invitrogen定向表达系统(ChampionTM pET directional TOPO expression system)进行克隆表达,纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的重组神经氨酸酶,分子量约53.8kDa.分析重组NA的免疫反应性和免疫原性,结果表明重组NA能与H5N1亚型病毒抗血清发生特异性结合,且其免异动物后能诱导机体产生特异性抗体,具有良好的抗原性.     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒NS1基因的克隆及其序列分析

目的：克隆H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并分析其序列特性。方法：通过RT-PCR方法克隆H5N1亚型禽流感病毒NS1基因,并对该基因片段进行测序,将此序列与数据库中不同时间、地点、宿主来源的H5N1亚型流感毒株NS1基因序列进行同源性比较。结果：获得了678bp的NS1全长基因,可编码225个氨基酸;其与毒株A／chicken／Jilin／hq／2003的同源性最高,二者的核酸和氨基酸的同源性分别为99．7％和99．1％。比对分析发现,该毒株NS1基因在第238-252位有15个核苷酸的缺失;进化树分析表明,它与1997年香港流行的H5N1亚型禽流感病毒毒株分别属于2个不同的分支。结论：克隆了一株H5N1亚型禽流感病毒的NS1基因,并初步分析了其序列特性,为进一步研究NS1基因的功能奠定了基础。     

H7N9亚型禽流感病毒非结构蛋白1(NS1)基因序列分析及2013上海分离株NS1的原核表达

目的:对2013年3月发生的感染人的新型H7N9亚型禽流感病毒的非结构蛋白1(NS1)基因序列进行同源性分析,构建NS1重组质粒并表达。方法:从GenBank获得2006~2013年不同来源的H7N9亚型病毒NS1序列,并进行同源性比较;利用PCR方法从H7N9亚型禽流感病毒株A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)基因组cDNA中扩增得到全长NS1基因,并将该片段定向克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a-NS1,经酶切鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,IPTG诱导表达,且进行Western印迹分析。结果:经序列分析,2013年暴发的H7N9型禽流感病毒的NS1基因核苷酸序列同源性为95%~100%,与之前暴发的H7N9型流感病毒NS1基因序列的同源性为86.4%~90.7%,表明2次暴发的该型流感分离株属于不同的进化分支;PCR扩增得到约680 bp的NS1基因序列,所克隆的NS1基因在原核细胞中的表达产物主要以包涵体形式存在,SDS-PAGE检测结果表明重组蛋白相对分子质量为25×103,Western印迹分析证实表达产物为H7N9禽流感病毒NS1蛋白。结论:为进一步研究H7N9亚型流感病毒NS1蛋白功能及基于NS1蛋白的抗病毒药物奠定了基础。     

Structural and functional analysis of NS1 and NS2 proteins of H1N1 subtype

Influenza A virus (H1N1), a genetic reassortment of endemic strains of human, avian and swine flu, has crossed species barrier to human and apparently acquired the capability of human to human transmission. Some strains of H5N1 subtype are highly virulent because NS1 protein inhibits antiviral interferon α/β production. Another protein NS2 mediates export of viral ribonucleoprotein from nucleus to the cytoplasm through export signal. In this paper, we have studied structure-function relationships of these proteins of H1N1 subtype and have determined the cause of their pathogenicity. Our results showed that non-conservative mutations slightly stabilized or destabi- lized structural domains of NS1 or NS1-dsRNA complex, hence slightly increased or decreased the function of NS1 protein and consequently enhanced or reduced the pathogenicity of the H1N1 virus. NS2 protein of different strains carried non-conservative mutations in different domains, resulting in slight loss of function. These mutations slightly decreased the pathogenicity of the virus. Thus, the results confirm the structure-function relationships of these viral proteins.     

A型流感病毒NS1蛋白羧基端PL结构域影响NS1在细胞核内的定位

A型流感病毒NS1蛋白羧基端4个氨基酸可以与PDZ结构域(the domain of PSD95,Dig and ZO-1)相结合,称为PL结构域(PDZ ligand domain)．对不同亚型或毒株的流感病毒而言,其NS1蛋白PL结构域的组成存在比较大的差异．有研究发现这种差异能够影响NS1与宿主细胞蛋白的相互作用进而影响病毒的致病力．为进一步探讨PL结构域对NS1蛋白生物学特性的影响,首先构建出4种不同亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H9N2)来源的NS1绿色荧光蛋白表达质粒．在此基础上,对野生型H3N2病毒NS1表达质粒进行人工改造,将其PL结构域缺失或者替换为其他亚型流感病毒的PL结构域,制备出4种重组NS1蛋白表达质粒．通过比较上述不同NS1蛋白在HeLa细胞中的定位情况发现,只有野生型H3N2病毒的NS1蛋白可以定位于核仁当中,而野生型H1N1、H5N1、H9N2病毒的NS1蛋白以及PL结构域缺失或替代的H3N2病毒NS1蛋白都不能定位于核仁．而通过比较上述NS1蛋白在流感病毒易感的MDCK细胞中的定位,进一步发现所有这些蛋白均不定位于核仁．上述结果表明：PL结构域的不同可以明显影响NS1蛋白在HeLa细胞核内的定位和分布,这有可能造成其生物学功能的差异．同时,NS1蛋白在细胞核内的定位还与宿主细胞的来源有着密切关系．     

H1N1型流感病毒神经氨酸酶的原核表达、纯化及免疫原性分析

目的：研究H1N1型流感病毒神经氨酸酶（NA）在原核系统中的表达、纯化方法及其免疫原性。方法：构建了大肠杆菌表达载体pET22b-NA,并转化了大肠杆菌BL21（DE3）;通过SP-Sepharose Fast Flow柱对重组NA进行分离纯化,并用Sephadex G-25柱对SP柱后获得的NA进行柱上复性;用不同剂量的重组NA免疫BALB/c小鼠,并检测其诱导产生的抗体滴度。结果：大肠杆菌表达的NA以包涵体形式存在,通过分离及柱上复性,纯化得到重组NA;NA抗原的免疫原性是剂量依赖的,随着剂量的增加,其免疫原性相应增强,3次免疫后,3μg NA诱导小鼠产生的抗体滴度最高,为1∶7000。结论：大肠杆菌表达的NA具有一定的诱导小鼠产生针对天然NA的抗体的能力,为流感病毒基因工程疫苗研究提供了初步线索。     

甲型H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段的克隆和表达

目的:分析比对甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)、聚合酶B2(PB2)和聚合酶A(PA)抗原的序列,克隆表达保守的和变异的表位抗原区段,为免疫学诊断试剂的研究提供候选抗原。方法:采用BioSun生物学软件比较新近公布的A/H1N1流感病毒和我国猪流感病毒浙江株NA、PB2和PA抗原序列,并预测筛选NA、PB2和PA抗原表位保守区段与变异区段,采用PCR逐步合成法合成NA、PB2和PA表位抗原区段基因序列,并利用原核表达载体pBVIL1进行克隆表达。结果:筛选的保守表位抗原区段和变异表位抗原区段为NA/135～180aa、NA/310～350aa、PB2/1～80aa、PA/41～90aa、PA/231～280aa和PA/341～400aa;获得6条表位抗原区段基因序列,且6条表位抗原区段均获得了高效表达,得到纯化后的抗原。结论:获得了A/H1N1流感病毒NA、PB2和PA表位抗原区段,为进一步研制特异的甲型流感病毒快速诊断试剂提供了抗原储备。