XJ-160病毒复制子型表达载体的构建

XJ-160病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,全基因组测序已经完成.本文利用该病毒全基因序列首先构建了全基因组cDNA克隆质粒,在此基础上,利用基因重组技术将病毒结构基因序列替换为含有多个单酶切位点的序列,得到复制子表达载体质粒pRepxj160.为验证载体的功能,将报告基因绿色荧光蛋白(EGFP)和β-半乳糖苷酶基因(lacZ)分别插入到载体的多克隆位点,得到两个表达质粒;经体外转录获得的转录体RNA转染BHK-21细胞后14h,可检测到报告基因的表达.结果表明我们构建的XJ-160病毒复制子型表达载体具有自主复制功能,可以表达异源基因.本研究为进一步开发具有我国自主知识产权的甲病毒载体奠定了基础.     

辛德毕斯病毒复制子载体系统的构建

To construct vector system of XJ-160 virus,a Sindbis virus isolated in China,recombinant vector pBRepXJ together with its helper plasmid pBR-H were derived from XJ-160 viral infectious clone pBR-XJ160 by overlap-PCR.To quantitatively and qualitatively verify the function of the replicon system,recombinant plasmids pSinRep-EGFP,pBRepXJ-EGFP,pSinRep-R and pBRepXJ-R were constructed by cloning report genes of enhanced green fluorescent protein(EGFP) or Renilla luciferase(R.luc) into pBRepXJ or pSinRep5,a comme...     

nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒XJ-160复制子载体特性的影响

为观察nsP2-726Pro定点诱变对辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)XJ-160复制子载体特性的影响,以XJ-160病毒复制子载体pBRepXJ为分子基础,利用定点诱变方法分别构建突变载体pBRep-726L、pBRep-726S、pBRep-726V和pBRep-726A。将新霉素抗性基因(Neomycinr,Neor)克隆到pBRepXJ和各突变载体中,通过细胞培养方法观察nsP2-726Pro定点诱变对载体致细胞病变作用(Cytopathic effect,CPE)的影响;并将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green-fluorescent protein,EGFP)和海肾萤光素酶(Renilla Luciferase,R.luc)报告基因分别插入到各载体中,定性与定量检测定点诱变对复制子载体自主复制能力的影响。实验结果表明,突变载体pBRep-726V和pBRep-726A在BHK-21细胞中的自主复制能力高于pBRepXJ,所诱发的细胞病变进程更快。替换突变nsP2-726Pro→Leu的引入使载体在保持包装能力的同时,完全丧失在细胞上引起CPE的能力。而pBRep-726S则具有中间表型。提示nsP2-726Pro定点诱变在影响XJ-160复制子载体自主复制能力的同时,也改变了CPE的进程。这将为研究辛德毕斯病毒基因组结构与功能的关系及构建非细胞病变的甲病毒载体奠定基础。     

辛德毕斯病毒载体的研究进展

辛德毕斯病毒（Sindbis virus,SIN）属于披膜病毒科（Togaviridae）甲病毒属（Alphavirus）,全世界各大洲均有分布,是由吸血的蚊虫等传播的虫媒病毒,可引起“辛德毕斯综合热”,表现为发热、倦怠、头痛、关节痛和皮疹等,可自愈。无论从病毒形态、结构、病毒复制和翻译等功能辛德毕斯病毒均集中体现了动物病毒的特征,使其成为研究动物病毒基本规律的模型病毒,因此对该病毒的研究成为热点。 　　自1983年Brenard Moss首次将痘苗病毒改造为痘苗病毒载体以来［1］,病毒载体的研究一直是病毒学中一个十分活跃的领域。早期的人们主要把精力集中在DNA病毒载体上,如痘苗病毒、腺病毒、疱疹病毒等［1］。     

一种基于塞姆利基森林病毒复制子的新型复制子载体

RNA复制子是能自主复制的病毒RNA。基于RNA复制子的表达载体和基因疫苗比常规真核表达载体和DNA疫苗具有更大的优越性。以塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的真核表达载体pSFV1为骨架 ,插入CMV立即早期启动子和SV40晚期Poly(A)信号 ,构建了一种完全基于DNA的复制型表达载体pSFV1CS ,将增强型绿色荧光蛋白基因EGFP插入其中 ,构建了重组质粒pSFV1CS EGFP ,通过转染 2 93T细胞 ,证实外源基因能在其中高效表达。该载体可用于表达真核蛋白和构建复制子载体疫苗。     

XJ-160病毒为辛德毕斯病毒新亚型

ＸＪ－１６０病毒是我国首次分离的辛德毕斯病毒,在对其全基因组核苷酸序列测定的基础上,对病毒基因组序列、病毒同源性和病毒系统进化等进行了较为详细的分析,结果表明：ＸＪ－１６０病毒具有典型的甲病毒属德毕斯病毒的序列特征。该病毒ｎｓｐ３蛋白基因中１１处制失及两处插入（４５１７￣５４８５）,涉及９０年核苷酸。核苷酸序列的系统进化分析表明,ＸＪ－１６０病毒属于辛德毕斯病毒欧洲／非洲亚组。病毒全基因组核苷酸序     

日本脑炎病毒(JEV)复制子表达载体的构建及其鉴定

在以往构建的JEV疫苗株SA14-14-2感染性克隆pBRkpn-JTF的基础上,构建了去除JEV结构区域基因(prM基因和E基因),保留非结构区域基因的复制子表达载体pCTCJEV、pCTMJEV,转染BHK-21细胞后,通过反转录PCR(RT-PCR)和间接免疫荧光实验(IFA)检测该载体的自主复制能力和蛋白表达情况,结果证实该载体在BHK-21细胞中能够自主复制并且表达非结构蛋白。进一步在该载体中插入报告基因EGFP,检测外源蛋白的表达情况,结果显示在转染复制子载体的24h后,荧光显微镜下能够看见绿色荧光蛋白的表达,阳性信号持续增强,能够维持10d左右,证实了构建的复制子载体pCTCJEV能够有效地表达外源蛋白,这为进一步建立以乙脑病毒复制子为基础的疫苗载体系统打下基础。     

昆津病毒复制子——一种新型病毒载体

病毒复制子 (Replicon) 是指来源于病毒基因组的能够自主复制的RNA分子,保留了病毒非结构蛋白基因,而结构蛋白基因缺失或由外源基因替代。昆津病毒 (Kunjun virus) 为黄病毒科黄病毒属成员,其复制子具有表达效率高、细胞毒性低、遗传稳定等特点,在病毒基因组复制调控机制、外源蛋白表达、新型疫苗和基因治疗等领域得到了广泛应用。以下就昆津病毒复制子系统的构建、特性及应用方面的研究进展作一综述。     

我国首次分离的辛德毕斯病毒(XJ-160病毒株)全基因组核苷酸序列测定

对我国首次分离的辛德毕斯病毒ＸＪ－１６０病毒株全基因组核苷酸序列进行测定,阐明该病毒基因组与国外株的差异,了解其分子致病机理。测序结果显示,ＸＪ－１６０病毒全基因组除５’末帽子结构和３’末多聚腺苷酸尾外共１１６２６个核苷酸,编码３７３１个氨基酸。非结构基因的编码区长７４６４核苷酸（６０ｎｔ￣７５２３ｎｔ）,编码２４８６氨基酸,翻译成四种非结构蛋白（ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ,ｎｓｐ     

中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160病毒株感染性全基因组cDNA克隆的构建与分析

报告了中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆的构建与鉴定。利用RT—PCR方法获得覆盖病毒全长基因组的cDNA片段,以低拷贝质粒pBR322作为骨架,将基因组cDNA置于SP6RNA聚合酶启动子之后,基因组3’末端带有35个连续的A,通过DNA重组技术组装成病毒基因组全长cDNA克隆。该克隆可在大肠杆菌DH5a中稳定扩增。经体外转录,RNA转录体转染BHK-21细胞,细胞发生病变,恢复病毒滴度达到10^7～10^8PFU／ml。全基因组cDNA克隆构建过程中引入的沉默突变(8453位核苷酸由C变为T)产生XbaⅠ酶切位点作为遗传标记,在子代恢复病毒的基因组中稳定存在。从细胞病变的特征、BHK-21细胞的空斑形态、病毒的抗原性、病毒在细胞中的生长动力学特征以及对乳鼠的致病性等方面比较,恢复病毒和亲本病毒XJ-160没有显著区别,提示获得了具有感染性的XJ-160病毒全长cDNA克隆。该病毒感染性全基因组cDNA克隆可以作为反向遗传学系统,为进一步研究病毒复制和致病机制,以及开发相应的载体表达系统提供分子生物学工具。     

基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体的构建

目的:以semliki森林病毒复制子为基础,构建一类可迅速高效表达shRNA的新型RNAi载体。方法:以Semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1为骨架,用CMV IE启动子替换SP6启动子并在3′-UTR下游插入SV40 polyA转录终止子,在原26S亚基因组启动子后插入带有相应改良多克隆位点的shRNA表达元件,同时加入抗新霉素选择复合体,并去掉3′-UTR的重复序列。所获载体用于沉默EGFP基因,通过体外细胞转染、病毒颗粒制备、荧光显微镜观察、RT-PCR分析等初步验证、评估其效果。结果:构建了基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体pSFV-RNAi Ready。经体外实验初步证实,该载体直接转染细胞,或与辅助载体共转染,制备成具有感染能力的重组病毒颗粒后使用,均可高水平表达shRNA,沉默目的基因。其中使用病毒颗粒抑抑效率可高达90%以上。结论:该载体的成功构建,可望显著拓宽SFV载体的应用范围,丰富RNAi实施手段,并用于相关科学研究及基因药物技术开发。     

基于DNA和RNA的双功能Semliki森林病毒复制子载体的构建

以semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1和辅助载体pSFV-helper2为骨架, 用CMV IE和T7启动子替换SP6启动子并在3′ UTR下游插入BGH转录终止子,构建了基于DNA和RNA的复制子表达载体pSMCTA和辅助载体pSHCTA。在DNA和RNA二种递送方式上证实该表达载体可高水平表达外源基因,与辅助载体共转染可制备具有感染能力并能表达外源基因的重组病毒颗粒。构建的基于DNA和RNA的双功能复制子载体显著地提高SFV载体应用范围,在体外可用于高水平表达外源基因及大规模制备重组病毒颗粒,在体内也可用于研制复制子疫苗和基因治疗载体。     

我国分离的XJ-90260病毒鉴定为西方马脑炎病毒

XJ－90260病毒是从新疆乌苏县境内采集的赫坎按蚊中分离到的一株病毒,病毒的鉴定结果显示：XJ－90260病毒可引起BHK－21细胞病变,表现为圆缩,脱落;可引起Vero细胞病变,表现为圆缩,破碎,脱落;可以在C6／36细胞中增殖,但不引起细胞病变。对3日龄小白鼠2－3天致死,对3周龄小白鼠3－4天致死。该病毒株对酸、乙醚敏感,抵抗5－氟脱氧尿苷。病毒与甲病毒组特异性免疫腹水起反应,与乙型脑炎病毒及布尼亚病毒组特异性免疫腹水不反应。进一步的分子生物学鉴定表明,该毒株基因组3′非编码区（ntranslated region,UTR）核苷酸序列具有典型的西方马脑炎病毒特征,与标准西方马脑炎病毒的首次报导,有重要的流行病学意义。我国9省区,886份血清的流行病学调查显示,该病毒抗体阳性血清24份,阳性率为2.71%。其中新疆（8／157）,河南（6／76）、甘肃（5／94）三省区抗体阳性数较多,占总阳性数的79.2%(19/24)。     

猪2型圆环病毒ORF2基因在塞姆利基森林病毒RNA复制子衍生的新型真核表达载体中的表达

猪 2型圆环病毒 (porcinecircovirus 2 ,PCV2 )是断乳仔猪多系统衰竭综合征 (postweaningmultisystemicwastingsyndrome,PMWS)的原发性病原。PCV2的ORF2编码病毒唯一的结构蛋白Cap。根据GenBank中公布的PCV2JXL株的序列设计一对引物 ,应用PCR方法从该毒株感染的PK 15细胞中扩增出完整的ORF2基因 ,将此基因克隆于本实验室此前构建的塞姆利基森林病毒 (SemlikiForestvirus,SFV)RNA复制子衍生的新型真核表达载体Psfv1cs中的BamHⅠ位点 ,获得重组质粒pSFV1CS Cap。用pSFV1CS-Cap分别转染BHK-21细胞和293T细胞 ,经间接免疫荧光试验检测表明 ,PCV2 ORF2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验表明 ,该重组质粒能诱导小鼠产生特异性抗体.