黄地老虎颗粒体病毒cDNA文库的构建

以感染黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum ganulosis virus,AsGV)的黄地老虎幼虫为材料提取总RNA、分离mRNA,并反转录合成cDNA,构建了包括黄地老虎(Agrotis segetura,As)幼虫和黄地老虎颗粒体病毒的cDNA文库.用EcoR Ⅰ和HindⅢ限制性内切酶酶切AsGV基因组DNA,制备地高辛探针,与上述总RNA、mR-NA、cDNA杂交,从文库中筛选出AsGV的阳性克隆1081个,经cDNA测序,cDNA编码序列与基因组编码序列相符.并根据基因组阅读框序列合成引物,PCR扩增出59个阅读框的编码基因,也完全与基因组序列相符.     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段的克隆与颗粒体蛋白基因的定位

用ｐＵＣ１９质粒作载体,克隆了黄地老虎颗粒体病毒（Ａｇｒｏｌｉｓｓｅｇｅｔｕｍｇｒａｎｕｌｏｓｉｓｖｉｒｕｓ,简称ＡｓＧＶ）ＤＮＡＰｓｔＩ－Ｄ．Ｅ．Ｆ．Ｇ．Ｈ．Ｊ．Ｋ．等７个片段。以［￣（３２）Ｐ］－ｄＣＴＰ标记的油桐尺蠖核型多角体病毒（Ｂｕｚｕｒａｓｕｐｐｒｅｓｓａｒｉａｎｕｃｌｃａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓｖｉｒｕｓ简称ＢｓＮＰＶ）多角体蛋白基因为探针,在３７℃条件下对ＡｓＧＶ）颗粒体蛋白基因进行了定位,将其分别定位于ＢｓｌⅡ－Ｓ或ＴＰｓＴＩ－Ａ或Ｂ和ＥｃｉＲＩ－Ａ片段上。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA片段在枯草芽孢杆菌中的克隆

EcoRI酶解的AsGV-XJ DNA和质粒pUB 110 DNA,经T4 DNA连接酶连接后,转化枯草芽孢杆菌BR 151感受态细胞,涂布在加有新霉素(5,ug／ml)的完全培养基上。用琼脂糖凝胶电泳快速法检测抗新霉素转化子中的重组质粒。在388个转化子中得到12个较PuB110 DNA分子量大的重组质粒。所有重组质粒均可与”PdcTP标记的Fco RI酶解AsGV—XJDNA片段的探针进行分子杂交。通过琼脂糖凝胶电泳对重组质粒中插入AsGV一XJ DNA 片段进行了测定。     

黄地老虎颗粒体病毒的研究VI．均一完整的AsGV DNA的制备和鉴定

本文采用氯化铯密度梯度一步离心,直接从纯化包涵体抽提出均一、完整的AsGV(Agrotissegetum granulosis virus)DNA分子。电镜观察和限制性内切酶二种方法测得AsGV DNA基因组大小为112．Okb。     

黄地老虎颗粒体病毒DNA的基因文库和物理图谱

利用EMBL 4——携带多切点连接序列的λ取代载体,建成了黄地老虎颗粒体病毒(AsGV)DNA基因文库,并绘制出AsGV DNA基因组的物理图谱。当体外包装效率达3 x 104pFU／μg DNA时,Sal和BamHI烈酶完全酶切的EMBL 4和BamHI部分酶切的AsGV DNA,按2：1的接头克分子比,用T4连接酶连接后,在BHB2688与2690体系中进行体外包装,再经在L95和ED 8654中的转染和转导,获得1．5×103噬菌斑。根据Clarke和Carbon公式,筛选概率达到复盖99％的AsGV基因组只需35个重组噬菌斑。我们随机挑取了35个重组噬菌斑,经快速琼脂糖凝胶电泳分析得到13个不同类型的重组噬菌斑,以32P标记的AsGV DNA为探针进行分子杂交,确定了BamHI在AsGV DNA基因组上位点的相邻位置。     

牛病毒性腹泻病毒基因组cDNA文库的构建

以牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）┥ｎＬ株的基因组ＲＮＡ为模板,经逆向转录酶作用,合成第一链ｃＤＮＡ,再以ＲＮａｄｓｅ／Ｈ与ＤＮＡ聚合酶Ｉ联合作用合成ｄｓｃＤＮＡ,并以ｄＣ同聚物尾化。ｐＵＣ８ＤＮＡ在Ｐｓｔ Ｉ酶解后,以ｄＧ同聚物尾化,两者退火构成重组质粒,转化到Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０１受体菌中,另以γ－＾３２Ｐ－ＡＴＰ标记ＢＶＤＶ ＲＮＡ制备探针,通过菌落原位杂交筛选重组子。酶切分配表明重组质粒插入     

PCR介导HaNPV罹病幼虫潜伏期cDNA文库的构建

以罹病棉铃虫幼虫为材料提取总RNA ,反转录合成cDNA第一链 ,加oligo(dG)同聚尾 ,PCR扩增合成双链cDNA ,克隆到 pGEM T质粒载体中。随机筛选文库中阳性克隆 ,经酶切分析 ,cDNA插入片段大小在 0 .3～ 1.1kb之间。文库中原代重组子数为 1.66× 10 5,重组百分比为 87.8%。重组质粒的杂交分析表明 ,文库中HaNPV基因的cDNA克隆所占比例超过 50 %。     

黄地老虎颗粒体病毒的研究IV包涵体、病毒粒子蛋白及其血清学的特性

利用反复调等电点的方法制备的AGV—XJ的包涵体A和B蛋白在沉降分析中均边一个峰的纯度。SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳显示AsGV—xJ的包涵体A蛋白有三个条带,其分子量分别为32,000、25,5 00和22,000。B蛋白和病毒粒子蛋白都由11个结构多肽组成,其分子量范围分别为100,o。0—22,500和95,0fll一12,000。我们还对AsGV—xJ的包涵体A蛋白作了氨基酸组成的分析。免疫扩散试验表明A、B蛋白和病毒粒子间均有血清学反应。     

黄地老虎颗粒体病毒enhancin-like基因的表达与增效功能研究

增效蛋白(ENHANCIN)是一种主要在昆虫杆状病毒中存在的杀虫增效因子,黄地老虎颗粒体病毒(Agrotis segetum granulovirus,AgseGV)基因组中有一个ORF的编码产物为杆状病毒ENHANCIN同源物,命名为en-hancin-like。生物信息学分析结果表明,AgseGV的enhancin-like基因编码产物含有ENHANCIN的保守域,无信号肽序列,不存在a-螺旋跨膜区,在其C-末端拥有类似哺乳动物的脯氨酸富集区。为了确定AgseGV的EN-HANCIN-like蛋白是否具有增效功能,构建了AgseGV的enhancin-like全基因和5′端片段(1 017bp)的原核表达载体。利用层析技术纯化截短片段的原核表达产物,以其为抗原制备了抗体。利用自制抗体和His-tag抗体,Western blot检测了enhancin-like全基因的表达产物。结果表明,在融合蛋白预期大小处显示出阳性条带,证明目的基因得到了良好的表达。以棉铃虫为供试虫进行生物测定,证明在棉铃虫核多角体病毒(HaNPV)浓度为1.17×102 PIBS/mL时,AgseGV enhancin-like的全基因原核表达产物能使其感染3龄初幼虫的死亡率提高16.25%,增效作用显著。但是,5'端截短片段的原核表达产物对HaNPV没有增效作用。     

正常人肝细胞cDNA文库的构建及应用分析

目的利用Gubler-Hoffman法构建了正常人肝细胞的cDNA文库以筛选肝细胞内部与乙肝病毒感染相关的基因。方法首先采用TRIzol法提取正常人肝细胞总RNA,纯化mRNA。逆转录合成单链cDNA,然后合成双链cDNA。用Spin Column回收0.4kb以上片段,然后与Vector pAP3neo进行连接,利用电刺激转化法导入E.coliDH10B,利用PCR法检测文库的重组效率。结果扩增后的文库重组率为93.3%。结论已经成功地构建了正常人肝组织的cDNA文库,该文库可用于筛选与乙肝相关的基因及用于基因芯片的制作。     

登革2型型内嵌合病毒全长cDNA克隆的构建

运用OL－PCR（Overlap PCR)方法,扩增出D2－04和D2－MON501结构蛋白区、5′非编码区等域的嵌合片段,以此片段替换pDVWS501质粒中的相应部分后,转化DH5α菌。测序结果表明,已成功构建含有D2－04株完整的PrM和E基因、一部分C基因,及D2－MON501株非编码区、非结构蛋白区和大部分C基因的嵌合病毒全长cDNA（QH－04／MON501）克隆。为进一步研究登革2型病毒结构蛋白区对毒力的影响打下基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒cDNA文库的构建及基因组序列的测定

猪繁殖与呼吸综合征自1987年首次在美国发现以来,几年之内便席卷了北美洲和欧洲大陆,后蔓延至许多亚太国家和地区 .我国1995年首次暴发此病,该病在我国普遍存在,给我国养猪业的健康发展造成巨大障碍.目前国内外尚无理想防疫疫苗.当前用于预防的猪繁殖与呼吸综合征的主要疫苗是弱毒苗和灭活疫苗.灭活疫苗免疫效果差,弱毒苗能提供较好的免疫保护,但毒力返强的几率相当高,这一点已在几年前丹麦等国因广泛使用弱毒苗而导致该病大暴发中得以证实.     

大鼠肾脏组织cDNA文库的制备和葡萄糖转运蛋白cDNA克隆的筛选

 大鼠的肾脏组织经匀浆后,提取纯化总RNA和mRNA合成cDNA,进行甲基化,加人工接头,最后连入载体(λgt11)和外壳蛋白包装步骤制成肾脏组织的cDNA文库。插入载体的cDNA长度为0.5kb到8kb之间。经反复稀释,测定出该文库的效价为1.5×10~7pfu/mL。     

cDNA文库的构建策略及其应用

cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要的作用。从cDNA文库中能筛选出所需要的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。cDNA文库是发现新基因和研究基因功能的基础工具。随着分子生物学技术的发展。cDNA文库构建方法有了很大改进和提高,就cDNA文库的构建方法及其应用进行综述。