兔出血症病毒中国株衣壳蛋白基因的克隆和序列分析

应用RT-PCR技术,从兔出血症病毒中国分离株WX84中成功扩增出预期大小为1.7kb的特异性条带,将扩增产物提纯后克隆入pGEMR-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,获得了该株病毒衣壳蛋白基因的克隆,序列分析表明扩增的中国株RHDV衣壳蛋白基因片段长度为1 740bp,共编码580个氨基酸.该核酸序列与其它国家报道的多株RHDV序列相互间同源性高达98.2%～99.0%,其推导的氨基酸序列同源性也达98.3%～99.1%,为极度保守片段.     

兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测

用分子克隆技术从兔出血症病毒(RHDV)中国早期流行株NJ85中成功克隆出vp60基因,序列分析表明基因长度为1740nt,编码579aa。利用GenBank数据库,NJ85与WX84、TP二个RHDV中国毒株vp60基因DNA序列的同源性分别为92．7％和97．2％,氨基酸序列的同源性分别为96．1％和98．6％,与其他国家16个毒株的vp60基因DNA序列的同源性在83．7％-97．0％之间,氨基酸序列的同源性在90．5％～99．0％之间,具有高度的同源性。进一步分析vp60基因的六个分区,A、B、D、F四个区变异率较低,C、E二个区变异率较高。在遗传进化上,历年来的RHDV毒株在氨基酸水平上分析可分为三个支谱系,在核苷酸水平上趋向四个支谱系,谱系没有呈现地域或时间特征。三个中国毒株分布在二个不同的支谱系中。与RHDV同为兔病毒属的欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)组成了另一个谱系。运用生物信息学方法分析了NJ85 VP60蛋白的分子量、等电点、疏水性和二级结构,根据同源模型预测分析了三级结构。NJ85 VP60的二级结构以B片层为主,三级结构稳定。病毒衣壳表面有32个杯状凹陷,由90个二聚体组成,二聚体由VP60单体以A／B5和C／C2两种方式构成,单体在二聚体中的构象有A、B、C三种形式。单体含有S、P两个结构域,两者通过柔性绞链连接,P结构域由VP60的C端部分形成,P分为P1和P2二个亚结构域,P2位于病毒衣壳表面,含有病毒株特异性抗原表位和红细胞结合位点。     

兔出血症病毒衣壳蛋白基因在毕赤酵母中的表达

将RHDVVP60基因插入酵母转移载体pPICZB中转化毕赤酵母菌GS115株 ,经筛选获得染色体基因组中整合入VP60基因的重组酵母菌。以甲醇诱导培养后经SDS-PAGE和Westernblot检测表达产物 ,在60kD处出现一特异蛋白条带 ,表明RHDV的衣壳蛋白得到了成功表达。血凝试验表明 ,表达的重组蛋白具有血凝特性 ,可以凝集人“O”型红细胞 ,血凝价达 2.8,同时 ,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察 ,重组酵母表达的衣壳蛋白可以在酵母菌体内自聚成大小约4.0nm ,和天然RHDV病毒子在物理形态上类似的病毒样颗粒 (VLPs)。该病毒样颗粒与兔抗RHDV高免血清作用后可被凝集成团 ,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似。     

兔出血症病毒遗传变异分析及RT—PCR检测方法的建立

目的获得兔出血症病毒（浙江分离株）近20年间遗传变异概况,建立兔出血症病毒的RT—PCR检测方法。方法对1989～2006年间的7株RHDV浙江分离株的衣壳蛋白基因（VP60）进行了克隆与测序,并与国内、外RHDV的基因组序列进行了遗传比对和分析;根据兔出血症病毒株的VP60设计引物,对20只人工感染兔的实质脏器、全血和350只实验兔全血样本进行了检测。结果7株RHDV的VP60基因均由1740个核苷酸组成,编码580个氨基酸。它们与参考序列之间的氨基酸同源性为94.0%～99.8%。系统发生树分析结果显示,RHDV可划分为2个大的基因群,浙江（中国）的RHDV分离株主要集中于C亚群。RT—PCR检测方法表明20只实验兔全部扩出预期条带,而350只实验兔全血检测中出现13只RHDV可疑样本。经血凝抑制试验检测,13例PCR阳性样品中有10个HAI阳性,3个阴性。检测敏感度达100%,特异性为99.12%,经统计检验,kappa=0.865,表明PCR检出RHDV的结果与HAI高度一致。结论RHDV基因群之间的遗传距离有逐渐加大的趋势。我们建立的RT—PCR法可用于RHDV浙江分离株的检测,用RT—PCR检测全血中RHDV方法的建立为活体检测RHDV打下了基础。     

SEM病毒中国株流行病学研究及克隆和序列分析

为了解SEN病毒中国株的流行病学及基因序列,采集肝炎患者（甲－戊型）、非甲－非戊型肝炎患者、ALT升高的婴幼儿、尿毒症患者、静脉毒瘾者和健康体检人群的血清标本,用巢式PCR检测SEN病毒,结果他们的检出率依次为13．3％、20．5％、4．8％、5．8％、5．7％和0。PCR获得了两 不同长度阳性片段。选取5份阳性PCR产物进行纯化、连接及转化,获取重组克隆,命名为pGCEM-SENVL(1、2、3）、pGEM-SENVS(1、2）,进行DNA序列分析。结果与SEN病毒（AX025667）序列同源性分别为87．7％、76．1％、88．2％、72．7％和78．8％。首次发现我国存在SEN病毒散发感染,并存在不同于SEN病毒（AX025667）的中国变异株,而且有同一患者存在两种变异株的复合感染。     

兔出血症病毒NJ85株衣壳蛋白变异性分析及立体结构预测

用分子克隆技术从兔出血症病毒(RHDV)中国早期流行株NJ85中成功克隆出vp60基因,序列分析表明基因长度为1740nt,编码579aa.利用GenBank数据库,NJ85与WX84、TP二个RHDV中国毒株vp60基因DNA序列的同源性分别为92.7%和97.2%,氨基酸序列的同源性分别为96.1%和98.6%,与其他国家16个毒株的vp60基因DNA序列的同源性在83.7%～97.0%之间,氨基酸序列的同源性在90.5%～99.0%之间,具有高度的同源性. 进一步分析vp60基因的六个分区,A、B、D、F四个区变异率较低,C、E二个区变异率较高.在遗传进化上,历年来的RHDV毒株在氨基酸水平上分析可分为三个支谱系,在核苷酸水平上趋向四个支谱系,谱系没有呈现地域或时间特征.三个中国毒株分布在二个不同的支谱系中.与RHDV同为兔病毒属的欧洲野兔综合征病毒(EBHSV)组成了另一个谱系.运用生物信息学方法分析了NJ85 VP60蛋白的分子量、等电点、疏水性和二级结构,根据同源模型预测分析了三级结构.NJ85 VP60的二级结构以β片层为主,三级结构稳定.病毒衣壳表面有32个杯状凹陷, 由90个二聚体组成,二聚体由VP60单体以A/B5和C/C2两种方式构成,单体在二聚体中的构象有A、B、C三种形式.单体含有S、P两个结构域,两者通过柔性绞链连接,P结构域由VP60的C端部分形成,P分为P1和P2二个亚结构域,P2位于病毒衣壳表面,含有病毒株特异性抗原表位和红细胞结合位点.     

鸭肠炎病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

目的：对DEV贵州分离株NP基因进行克隆与序列分析,构建NP基因的原核表达载体,分析NP基因原核表达产物的免疫反应性。方法：根据GeneBank登载的DENNP基因序列设计引物,对DEV贵州分离株进行PCR扩增、克隆和测序,采用生物信息学软件程序分析NP蛋白的氨基酸序列;将该基因插入到原核表达载体pET32a上进行原核表达和Western Blotting分析。结果：DEV贵州分离株NP基因全长759bp,核苷酸序列与参考株一致;NP基因编码蛋白相对分子量为27．1kDa,理论pI为5．89,肽链上第10．15、88．92和182．186区段及其附近区域可能是B细胞表位优势区;构建得到的重组质粒pET32-NP可表达出一条大小约为48kDa的蛋白,且能与兔抗DEN-IgG发生特异性结合。结论：NP基因在DEN基因组中高度保守,其原核表达产物具有良好的免疫反应性。     

N端融合外源蛋白的兔出血症病毒衣壳蛋白自聚能力的研究

将兔出血症病毒衣壳蛋白VP6 0基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBACHIS2_B的 6 HIS表达标签下游 ,与线性化野生型杆状病毒基因组DNA共转染Sf9昆虫细胞 ,经蚀斑纯化后获克隆化重组杆状病毒pBLUEBACHIS2B_VP6 0。以重组杆状病毒感染Sf9细胞 ,经SDS_PAGE和Westernblot检测显示高效表达一分子量为 6 9kD的重组蛋白 ,并且该蛋白可被兔抗RHDV高免血清识别。血凝试验表明 ,该重组蛋白可以凝集人“O”型红细胞 ,血凝价达 2 1 6 ,同时 ,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制。经电镜观察 ,重组病毒表达的融合有 6 HIS表达标签的衣壳蛋白仍可在昆虫细胞内自聚成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上相似的病毒样颗粒 (VLPs) ,并且该VLPs与兔抗RHDV高免血清作用后于电镜下可见凝集成团的现象 ,表明其与天然RHDV病毒粒子在抗原性上也极为相似     

SEN病毒中国株流行病学研究及克隆和序列分析

为了解SEN病毒中国株的流行病学及基因序列 ,采集肝炎患者 (甲～戊型 )、非甲～非戊型肝炎患者、ALT升高的婴幼儿、尿毒症患者、静脉毒瘾者和健康体检人群的血清标本 ,用巢式PCR检测SEN病毒 ,结果他们的检出率依次为 13 3%、2 0 5 %、4 8%、5 8%、5 7%和 0。PCR获得了两种不同长度阳性片段。选取 5份阳性PCR产物进行纯化、连接及转化 ,获取重组克隆 ,命名为 pGCEM -SENVL(1、2、3)、pGEM -SENVS(1、2 ) ,进行DNA序列分析。结果与SEN病毒 (AX0 2 5 6 6 7)序列同源性分别为 87 7%、76 1%、88 2 %、72 7%和 78 8%。首次发现我国存在SEN病毒散发感染 ,并存在不同于SEN病毒 (AX0 2 5 6 6 7)的中国变异株 ,而且有同一患者存在两种变异株的复合感染     

Oral Immunization using Tuber Extracts from Transgenic Potato Plants Expressing Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Capsid Protein

Rabbit hemorrhagic disease, which is caused by a calicivirus, is a lethal infection of adult animals that is characterized by acute liver damage and disseminated intravascular coagulation. In this study, we report the production of the major structural protein VP60 of rabbit hemorrhagic disease virus in transgenic tubers of potato plants and its use as an oral immunogen in rabbits.     

赤羽病病毒核蛋白基因克隆和序列分析

参考GeneBank发表的赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)的核蛋白基因(SmRNA)序列,设计合成一对引物,从分离自牛体的AKAV BHK21细胞培养物中提取总RNA,对AKAV核蛋白基因进行RT-PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约696bp的条带,回收纯化后,将其克隆至pMD18-T质粒载体中,然后进行核苷酸序列分析.与GenBank中报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白(N)的SmRNA基因比较后发现,与其它株的核苷酸的同源性为94.2%～98.3%,推导的氨基酸的同源性为97.6%～100%,证实为AKV的N基因.为生产AKAV特异性核蛋白抗原、免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础.     

在昆虫细胞中表达能自聚成病毒样颗粒的兔出血症病毒衣壳蛋白

将兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因插入杆状病毒转移载体pBLUEBAC 4,获得重组转移载体pBLUEBAC4-VP60.在脂质体转染试剂介导下,将重组杆状病毒转移载体pBLUEBAC4-VP60 与线性化的野生型杆状病毒基因组DNA共转染对数生长期的Sf9昆虫细胞,经过三轮蚀斑纯化后,获得了克隆化的重组杆状病毒pBLUEBAC4-VP60.以重组杆状病毒感染Sf9细胞后,收获细胞培养上清和细胞裂解液上清,SDS-PAGE电泳分析显示,重组病毒pBLUEBAC4-VP60表达一分子量各为60kD左右的特异性重组蛋白,并且该重组蛋白经Western blot检测,皆可被兔抗RHDV高免血清所识别,表明VP60蛋白基因在重组杆状病毒感染的Sf9昆虫细胞中得到了表达,并且具有与天然VP60相似的抗原性.血凝试验表明,表达的重组蛋白具有血凝特性,可以凝集人"O"型红细胞,血凝价为213.同时,该血凝性可被抗RHDV的高免血清所抑制.经电镜观察,重组病毒表达的衣壳蛋白可以在没有其他任何成分存在的条件下,在昆虫细胞内也能自然聚合成不包裹核酸的、与天然RHDV病毒粒子在物理形态上类似的病毒样颗粒(VLPs).在与兔抗RHDV高免血清37℃作用1h后,该病毒样颗粒于电镜下观察可出现凝集成团的现象,表明该VLPs与天然RHDV在抗原性上也极为相似.     

赤羽病病毒核蛋白基因克隆和序列分析

参考GeneBank发表的赤羽病病毒(Akabane virus,AKAV)的核蛋白基因(SmRNA)序列,设计合成一对引物,从分离自牛体的AKAVBHK21细胞培养物巾提取总RNA,对．AKAV核蛋白基因进行RT-PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约696bp的条带,同收纯化后,将其克隆至pMD18-T质粒载体中,然后进行核苷酸序列分析。与GenBank中报道的多株AKAV编码核衣壳蛋白(N)的SmRNA基因比较后发现,与其它株的核苷酸的同源性为94．2％～98．3％,推导的氨荜酸的同源性为97．6％～100％,证实为AKV的N基冈。为生产AKAV特异性核蛋白抗原、免疫血清学诊断试剂的制备和分子生物学研究打下了坚实基础。     

建兰花叶病毒运动蛋白基因克隆及序列分析

从建兰花叶病毒 (CyMV)石斛兰分离物中提取病毒RNA ,用反转录———聚合酶链式反应 (RT PCR)方法获得约 5 0 0bp的运动蛋白基因片断 ,插入 pGEM T载体克隆并测序。序列分析表明 ,该基因片断由 474个核苷酸组成 ,和CyMV美国夏威夷分离物、新加坡分离物相应基因核甘酸序列分别具有 97.8%同源性 ;根据核酸序列推导该片断含有 3个部分重叠的开放阅读框架 (ORF) ,分别编码 14kD、12kD和 10kD的多肽     

6株O型口蹄疫病毒结构蛋白vp1基因的克隆与序列分析

提取6株O型口蹄疫病毒(FMDV)(T1-T6)的RNA,用一对通用引物经RT-PCR方法将6株FMDVVP1基因片段扩增出来。克隆测序,核苷酸序列分析表明,T1-T6六株vp1基因的核苷酸序列同源性在95%～99.8%之间,氨基酸序列同源性在94.8%～100%之间。T1-T6六株病毒vp1基因的核苷酸序列与已经发表的O/HKN/14/82、O/TAW/81/97、O/PHI/7/96、O/HKN/1/99和O/HKN/16/96的同源性较高,核苷酸序列同源性在86.1%～95.8%之间;发现6株毒株的主要中和抗原表位140-160、200-213位的氨基酸序列完全相同,推测它们有相近的中和抗体表位和抗原性。故推断本试验中的6株FMDV株属于同一基因型,即FMDVO型中国拓朴型(Cathaytopotype)。