汉滩病毒核蛋白羧基端多肽原核表达载体的构建及表达

本文为建立分型检测方法,探讨了汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)核蛋白羧基端多肽的抗原性.首先,分别构建编码HTNV核蛋白及其羧基端多肽的原核表达载体pRSET A-S、pRSET A-S-C;然后,将其转化入表达菌BL21(DE3)pLySs诱导表达,采用SDS-PAGE、Western-blot进行鉴定.我们成功构建了pRSET A-S及pRSET A-S-C原核表达载体.SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达,呈不溶状态,Western-blot显现目的蛋白具有良好的抗原性.为大量制备分型用核蛋白多肽抗原创造了条件.     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒Ｓ基因４种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达。结果表明表达的４种ＧＳＴ－ＮＰ融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于茵体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的２９－３６％,分子量分别约为７２ｋＤ、６６ｋＤ、５４ｋＤ和４４ｋＤＤ。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示５４ｋＤ和７２ｋＤ融合蛋白用酶标记汉滩病毒ＮＰＭｃＡｂｌＡ８和抗ＧＳＴ ＭｃＡｂ ３Ｃ１１染色呈阳反应。６６ｋＤ和４４ｋＤ融合蛋     

汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒S基因4种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达.结果表明表达的4种GST-NP融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于菌体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的29-36%,分子量分别约为72 kD、66 kD、54 kD和44 kD.Western blot显示54 kD和72 kD融合蛋白用酶标抗汉滩病毒NP McAb 1A8和抗GST McAb 3C11染色呈阳性反应.66 kD和44 kD融合蛋白仅与酶标3C11呈阳性反应.用凝血酶切去GST,获得4种汉滩病毒重组核蛋白(rNP),分子量分别约为44 kD、40 kD、26 kD和16 kD.用19株McAb对表达产物做抗原位点分析,结果完整的rNP可与19株McAb中的13株反应,McAb反应谱与天然NP相同;S1.1 kb表达产物(N-端1-37和C端402-429位aa缺失)和S 0.5 kb表达产物(N-端1-274位aa缺失)与19株McAb均不发生反应;S0.7 kb表达产物(C-端275-429位aa缺失)可与5株组特异性McAb反应.表明汉坦病毒核蛋白上的抗原位点主要存在于N-端1-37位aa区段内.     

汉滩病毒S基因及其5‘端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒（ＨＴＮＶ）Ｓ基因及其５'端表达的意义,为核蛋　白Ｔ细胞表位的研究奠定基础。设计２套引物,用ＰＣＲ方法从ＰＢＶ２２０－Ｓ２２原核质粒中扩增出Ｓ　基因全读码框（３７－１３２６ｂｐ）及Ｓ基因５'端（３７－５０１ｂｐ）,用ＴＡ克隆将其克隆入ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯ载体中,成功构建ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体,并通过脂质体转　染至Ｖｅｒｏ细胞中,进行了瞬时表达。间接免疫荧光成功检测到ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ在Ｖｅｒｏ细胞中的表达。ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ及ｐｃＤＮＡ３．１－Ｓ－Ｎ真核表达载体有较高的转染效率,目　的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究ＨＴＮＶ－Ｓ基因在Ｔ细胞表位研究中的意义。     

汉滩病毒S基因及其5'端真核表达载体的构建及在细胞中的表达

体外研究汉滩病毒(HTNV)S基因及其5'端表达的意义,为核蛋白T细胞表位的研究奠定基础.设计2套引物,用PCR方法从PBV220-S22原核质粒中扩增出S基因全读码框(37-1326bp)及S基因5'端(37-501bp),用TA克隆将其克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中,成功构建pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体,并通过脂质体转染至Vero细胞中,进行了瞬时表达.间接免疫荧光成功检测到pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N在Vero细胞中的表达.pcDNA3.1-S及pcDNA3.1-S-N真核表达载体有较高的转染效率,目的基因能在宿主细胞中表达,有利于研究HTNV-S基因在T细胞表位研究中的意义.     

汉滩病毒截短S基因重组梭菌载体构建及表达

目的：构建含汉滩病毒截短核蛋白基因的重组质粒,并在口服疫苗载体产气荚膜梭菌中表达。方法：以质粒pGEX-4T-2/SA为模板,PCR扩增汉坦病毒截短核蛋白（SA）基因片断,克隆入穿梭载体pJRC200,构建重组质粒pJRC200-SA,转化E.coliDH5α,酶切鉴定。将pJRC200-SA电穿孔转化产气荚膜梭菌,厌氧培养,促芽孢形成诱导蛋白表达。超声裂解产气荚膜梭菌芽孢,对裂解产物进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定。结果：酶切、测序表明,SA基因片段被正确插入pJRC200中,Western blotting分析显示SA蛋白成功表达,并能被肾综合征出血热患者阳性血清特异性识别。结论：汉坦病毒截短核蛋白重组克隆构建成功,并能在产气荚膜梭菌中成功表达,为口服疫苗研发奠定了基础。     

插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

肾综合征出血热(HFRS)是一类由汉坦病毒引起的以发热、出血和急性肾功能损伤为特征的急性病毒性传染病.     

汉滩病毒膜蛋白重组腺病毒的构建表达及免疫效果研究

探讨利用腺病毒载体作为汉滩病毒基因工程疫苗载体的可行性。通过PCR扩增,得到完整的汉滩病毒76-118株M片段编码区,将该片段克隆入质粒pAdTrackCMV的CMV启动子下游,得到阳性克隆pAdTrackCMV—M。Pmel线性化的阳性克隆与腺病毒骨架载体pAdEasy—1共转化大肠杆菌BJ5183,经同源重组后得到重组病毒pAdEasy—M。pAdEasy—M经PacI线性化后,脂质体介导转染293细胞,经Western—blot检测表明,G1、G2基因在293细胞中得到表达。重组病毒免疫BALB／c小鼠,产生了具有一定中和活性的抗体。该研究为进一步研制以腺病毒为活载体的工程疫苗奠定了基础。     

插入CpG序列的汉坦病毒S基因真核表达载体的构建及表达

To improve the effect of the gene immunization against Hantaan virus, we constructed the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) containing Hantaan Virus S gene coding region and CpG motif by cloning S gene segment with CpG motif into eukaryotic expression vector pTARGET^TM.After conformed by enzyme analysis, the recombinant expression vector pTARGET-hans(ISS) was transferred into Vero-E6 cells by electroporation and the transient expression of Hantaan virus nucleocapsid protein was detected by indirect immunofluorescence assay(IFA). In some transferred Vero-E6, the green fluorescence was showed, thus we can conclude that the eukaryotic expression vector pTARGET-hans(ISS) was successfully constructed and expressed in vitro,which will lay a foundation for further animal vaccination.     

植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体构建及表达

旨在构建植原体免疫主导膜蛋白Imp基因原核表达载体,并进行初步表达。以重组克隆质粒pMD18-T-Imp为模板,PCR扩增Imp基因片段。构建表达载体pET-28a(+)-Imp,转化宿主菌E.coliBL21(DE3)。筛选阳性克隆,提取重组质粒作PCR鉴定、酶切鉴定及IPTG诱导表达鉴定。PCR及双酶切结果显示,重组质粒pET-28a(+)-Imp构建成功。经IPTG诱导BL21(pET-28a(+)-Imp)表达约20 kD的蛋白,与预期的携带6×His-Tag的目的蛋白(19.5 kD)大小相符,主要以包涵体形式存在。结果显示,构建的表达载体pET-28a(+)-Imp在E.coliBL21(DE3)中能够达一定量表达,为进一步纯化Imp蛋白奠定基础。     

大鼠D-双功能蛋白基因原核表达载体的构建及表达

利用原核表达系统构建大鼠D-双功能蛋白表达载体。设计基因拼接引物,通过RT-PCR合成DBP基因cDNA序列,将酶切、纯化的DBP基因与经相同处理的表达载体pET-28 a相连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性重组子。将通过酶切及序列分析鉴定阳性的重组子质粒转入感受态大肠杆菌BL21-gold表达菌中,经IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE分析目的蛋白表达情况。结果显示,成功获得了包含DBP基因的双链cDNA序列,酶切、序列分析及Western blotting证实成功构建了DBP基因的原核表达载体。通过原核表达系统,DBP蛋白以包涵体形式产生,复性后可获得高表达的目的蛋白。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达研究

采用RT—PCR方法自猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组分离出核衣壳蛋白基因(ofr7),克隆到pMDl8—T载体构建成重组质粒pMDl8N并进行测序比较,结果表明,所克隆的核衣壳蛋白基因序列与PRRSV美洲型ATCCVR—2332株的同源性为100％,表明ofr7是PRRSV基因组内很保守的序列;将ofr7亚克隆到原核表达载体pGEX—KG,构建成重组质粒pGEX—KGN,用pGEX—KGN转化表达菌株BL21,经SDS—PAGE和Western-blot分析表明：克隆在谷胱苷肽转移酶(Glutathione S-transferase(GST)下游的核衣壳蛋白基因与GST获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST—N分子量约为41kDa,并且有免疫学反应活性;这为猪繁殖与呼吸综合征的血清学诊断方法的建立打下了基础。     

Serial Expression of the Truncated Fragments of the Nucleocapsid Protein of CCHFV and Identification of the Epitope Region

The Crimean-congo hemorrhagic fever virus(CCHFV)is a geographically widespread fatal pathogen. Identification of the epitope regions of the virus is important for the diagnosis and epidemiological studies of CCHFV infections.In this study,expression vectors carrying series truncated fragments of the NP(nucleocapsid protein)gene from the S fragment of CCHFV strain YL04057 were constructed.The recombinant proteins were expressed in E.coli and purified for detection.The antigenic of the truncated fragments of ...     

SARS病毒核蛋白基因的克隆及其表达研究

从一例输入性传染性非典型性肺炎病人血清中提取病毒RNA,通过RT—PCR方法扩增出SARS病毒核蛋白基因片段,克隆入质粒载体pUCm—T后,进行核苷酸序列的测定及分析,与已公布的SARS病毒基因序列进行比较,证实为SARS冠状病毒核蛋白基因。为了解该病毒核蛋白的抗原特性,将核蛋白基因插入表达载体,构建重组质粒pET28a—SN,转导大肠杆菌BL21(DE3)后,加IPTG诱导表达。产物经SDS—PAGE电泳分析,表达出相对分子量约为50kDa的蛋白,占整个菌体的45％左右。Westem—blot分析表明,表达产物仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常血清不起反应。间接ELISA免疫检测,抗原滴度达1：12500。表明表达的核蛋白为SARS特异性抗原,这为SARS病毒的诊断试剂的研制提供了方便而安全的抗原来源。     

犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

核蛋白基因(N)位于犬瘟热病毒基因组的108—1679位置处,是保守性较强的免疫原性蛋白,因此选择N基因作为目的基因,利用酶切、连接等方法构建了含犬瘟热病毒核蛋白基因的穿梭质粒pVAX?E3LPN。以含CAV-2SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建了重组质粒pCAV-2-CDVLPN,利用脂质体介导法转染MDCK细胞,转染三次后,细胞出现了典型的腺病毒样病变。电镜负染、切片观察,酶切、PCR扩增及测序鉴定的结果表明表达犬瘟热核蛋白基因的重组犬2型腺病毒构建成功,表达的核蛋白分子量为58kDa。     

SARS病毒核蛋白基因的克隆及其表达研究

从一例输入性传染性非典型性肺炎病人血清中提取病毒RNA,通过RT-PCR方法扩增出SARS病毒核蛋白基因片段,克隆入质粒载体pUCm-T后,进行核苷酸序列的测定及分析,与已公布的SARS病毒基因序列进行比较,证实为SARS冠状病毒核蛋白基因.为了解该病毒核蛋白的抗原特性,将核蛋白基因插入表达载体,构建重组质粒pET28a-SN,转导大肠杆菌BL21(DE3)后,加IPTG诱导表达.产物经SDS-PAGE电泳分析,表达出相对分子量约为50kDa的蛋白,占整个菌体的45%左右.Western-blot分析表明,表达产物仅与SARS阳性病人血清起反应,而与正常血清不起反应.间接ELISA免疫检测,抗原滴度达112500.表明表达的核蛋白为SARS特异性抗原,这为SARS病毒的诊断试剂的研制提供了方便而安全的抗原来源.     

犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

核蛋白基因(N)位于犬瘟热病毒基因组的108-1679位置处,是保守性较强的免疫原性蛋白,因此选择N基因作为目的基因,利用酶切、连接等方法构建了含犬瘟热病毒核蛋白基因的穿梭质粒pVAXAE3LPN.以含CAV-2 SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建了重组质粒pCAV-2-CDVLPN,利用脂质体介导法转染MDCK细胞,转染三次后,细胞出现了典型的腺病毒样病变.电镜负染、切片观察,酶切、PCR.扩增及测序鉴定的结果表明表达犬瘟热核蛋白基因的重组犬2型腺病毒构建成功,表达的核蛋白分子量为58kDa.