棉铃虫核型多角体病毒sod基因在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从棉铃虫(Helicoverpa armigera)单粒包埋型核型多角体病毒(HaSNPV) C1株基因组中扩增sod基因编码区,克隆到pGEM-T-easy vector,测定了核苷酸序列.将基因编码区克隆到原核表达载体pETblue2,构建了含表达质粒pETblue2/HaSNPV SOD,转化大肠杆菌DE3(BL21)进行IPTG诱导表达. SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细胞总蛋白的37%.邻苯三酚法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物校正酶活力单位为694U/mg.     

甜菜夜蛾核多角体病毒sod基因的克隆及原核表达

甜菜夜蛾核型多角体病毒中国株(Spotoptera exigua MNPV—Z)超氧化物歧化酶基因(sod)业已被克隆及在大肠杆菌中进行了表达,证明了SeMNPV—Z的sod基因产物确有SOD活性,其活力单位约为291．19U／mL培养液。DNA测序结果表明SeMNPV-Z的sod基因编码151个氨基酸,与人的sodl基因的核苷酸的同源性为50％,与LdNPV、HaSNPV、HcNPV、AcNPV和BmNPV的sod基因的同源性分别为64％、63％、63％、65％、63％。     

棉铃虫核多角体病毒泛素基因的克隆表达及抗体制备

昆虫杆状病毒和痘病毒是目前已知唯一编码泛素基因的病毒。通过PCR方法,克隆了棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素基因(Ubiquitin,Ubi)。序列分析表明,该基因编码区全长252bp,编码83个氨基酸残基,预计分子量为9.24kDa。将泛素基因克隆到原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pETUbi,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合蛋白。用Histag抗体检测目的蛋白,Westenblot实验证明所表达的蛋白是带有Histag的重组融合蛋白。通过改变IPTG浓度和诱导时间对表达条件进行了优化。利用NI琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化目的蛋白,SDSPAGE鉴定为单一条带,同时用提纯蛋白制备了特异性抗体,为进一步的研究打下基础。     

棉铃虫核多角体病毒泛素基因的克隆表达及抗体制备

昆虫杆状病毒和痘病毒是目前已知唯一编码泛素基因的病毒.通过PCR方法,克隆了棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素基因(Ubiquitin,Ubi).序列分析表明,该基因编码区全长252bp,编码83个氨基酸残基,预计分子量为9.24kDa.将泛素基因克隆到原核表达载体pET-28a上,构建重组质粒pET-Ubi,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,IPTG诱导表达融合蛋白.用His-tag抗体检测目的蛋白,Westen-blot实验证明所表达的蛋白是带有His-tag的重组融合蛋白.通过改变IPTG浓度和诱导时间对表达条件进行了优化.利用NI-琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE鉴定为单一条带,同时用提纯蛋白制备了特异性抗体,为进一步的研究打下基础.     

HaSNPV几丁质酶基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达及其产物对Bt杀虫剂的增效作用

为了探索杆状病毒几丁质酶对微生物杀虫剂的增效作用及其利用途径 ,分别在大肠杆菌和昆虫细胞中表达棉铃虫单粒包埋型核型多角体病毒 (HaSNPV)几丁质酶 .用PCR方法扩增出不含N端信号肽编码序列的几丁质酶基因片段 ,并分别克隆至原核表达载体pET2 8a和重组到杆状病毒BactoBac表达系统 ,在大肠杆菌 (E .coli)BL2 1和粉纹夜蛾 (Trichoplusiani)细胞系Tn 5B1 4中分别进行了表达 .在大肠杆菌中表达量约占细菌总蛋白 15 % ,在昆虫细胞中表达量约占细胞总蛋白10 % .将含有几丁质酶的大肠杆菌和昆虫细胞表达产物添加到苏云金杆菌 (Bt)菌液中一起喂食 2龄家蚕 .结果显示 ,HaSNPV几丁质酶基因的 2种表达产物和Bt杀虫剂的混合物使处理的家蚕的致死时间较对照处理均明显缩短 .昆虫细胞和大肠杆菌表达产物与Bt混合物处理的LT50 分别从 93 5h和 95 1h缩短到 5 6 2h及 6 7 2h ,并且供试家蚕的生长速度明显缓慢 .研究结果表明 ,重组的HaSNPV几丁质酶有望作为Bt杀虫剂的增效剂     

胰岛素样生长因子结合蛋白-7基因的克隆和表达

IGFBP-7是胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)家族中的一员,具有一些抑癌基因的特征。利用重组PCR技术获得了IGFBP-7基因的全长编码区序列,并将其克隆到pcDNA3．1／His—Myc真核表达载体中,得到重组质粒pcDNA3．1／His—Myc—IGFBP-7。将该重组质粒瞬时转染人胚胎肾293T细胞,Westem-blot分析表明,IGFBP-7在293T细胞中获得了表达,为进一步研究IGFBP-7的功能奠定了基础。     

大肠埃希菌Mn-SOD基因的克隆、表达及多克隆抗体制备

目的实现Mn-SOD基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达,制备Mn-SOD的多克隆抗体。方法用PCR方法从一株野生型大肠埃希菌（E.coli）基因组中扩增Mn-SOD基因编码区．将它克隆到原核表达载体上进行大量表达和纯化,再用纯化的蛋白对新西兰大白兔进行背部多点注射,40d后取其血清,用Western-blot印迹实验测定抗体效果。结果SDS-PAGE分析表明SOD的表达量约为细菌总蛋白的50％;黄嘌呤氧化酶法测定表达蛋白活性,结果表明每毫克菌体可溶性总蛋白中表达产物酶比活为3921．77U／mg,是对照BL21的276．77倍;并制备了高效价的多克隆抗体。结论该研究成功地构建了大肠埃希菌Mn-SOD基因高效原核表达系统,所表达的Mn-SOD具有良好的免疫原性和免疫反应性。     

中华蜜蜂蜂毒磷脂酶A_2基因在大肠杆菌中的表达(英文)

将中华蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AcPLA2)蛋白成熟肽编码区基因(405 bp)克隆至表达载体pETBlue-1,在大肠杆菌Tuner(DE3)plac I中诱导表达,经SDS-PAGE电泳检测,表达产物分子量为15kD,约占细菌总蛋白的4.6％;用意大利蜜蜂蜂毒磷脂酶A2(AmPLA2)纯品制备的兔源多克隆抗体为一抗作Western blot,表达产物显示类似于天然纯AmPLA2的特异性印迹,证实AcPLA2基因已在大肠杆菌中得到表达。     

H3N2亚型禽流感病毒核蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的:获得H3N2亚型禽流感病毒核蛋白(NP)全长基因,并在大肠杆菌中表达,以用于对NP功能的研究。方法:从感染了H3N2亚型禽流感病毒的MDCK细胞培养液中收获病毒,提取病毒RNA,用RT-PCR扩增出NP基因的编码区序列,将其定向克隆到pTIG-TRX原核表达载体并测序,在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达,用SDS-PAGE和Western印迹检测表达产物。结果:所克隆的核苷酸片段包含了NP基因编码区完整阅读框架,编码498个氨基酸;构建的重组表达载体在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达出相对分子质量约66000的重组蛋白。结论:克隆和表达了禽流感病毒核蛋白编码区基因,为获得大量NP以制备抗体,以及对其进行功能性研究奠定了基础。     

白鹅催乳素基因的克隆及诱导表达条件的优化

摘要: 运用RT-PCR方法, 从白鹅脑垂体总RNA中扩增得到了催乳素(Prolactin, PRL)基因编码区序列cDNA, 并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列分析表明, PRL cDNA包括终止密码子在内的长度为690 bp,编码230个氨基酸残基的蛋白质, 与皖西白鹅的有所差异, 二者碱基同源性在99.57%, 氨基酸同源性达99.56%。将PRL基因编码区序列cDNA定向克隆到表达载体pET-32a (+)中, 构建表达质粒pET-32a(+)-PRL。该质粒的BL21 (DE3)转化菌在IPTG的诱导下可表达PRL基因融合蛋白, IPTG终浓度1 mmol/L, 37℃, 诱导4 h表达量最高, 表达量约占菌体总蛋白的28.96%。     

3α-羟类固醇脱氢酶基因的质粒载体构建和表达

目的 实现3α-羟类固醇脱氢酶基因在大肠埃希菌中的高可溶性表达.方法 从土壤中分离睾丸酮丛毛单胞菌,提取其基因组DNA,PCR扩增3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)基因,将它克隆到原核表达载体上进行诱导表达.提取细菌总蛋白进行SDS-PAGE分析并测定酶活性.结果 经核苷酸序列测定和酶切鉴定结果表明,成功地构建了重组质粒,IPTG诱导表达后,获得融合蛋白,SDS-PAGE初步测定目的蛋白的相对分子量约为29kDa,与预期理论值一致;酶活性测定结果表明菌体可溶性总蛋白HSD酶比活性为142.81 U/mg,是对照BL21的12.97倍.结论 该研究成功地构建了3α-羟类固醇脱氢酶基因高效原核表达系统,为利用基因工程手段大量制备3α-HSD的工作奠定了基础.     

Mmp2基因克隆及其对肝癌细胞的作用

克隆人基质金属蛋白酶-2基因(Mmp2)编码区并构建重组真核表达载体pEYFP-Mmp2,研究其在肝癌细胞中的作用。以肝癌细胞Hep G2的总RNA为模板,通过RT-PCR获得cDNA,并通过PCR获得Mmp2基因编码区。经TA克隆和测序鉴定将无任何突变的Mmp2基因编码区插入到真核表达载体pEYFPN1中,构建p EYFP-Mmp2重组真核表达载体并进行酶切鉴定和测序鉴定。pEYFP-Mmp2稳定性转染肝癌细胞,经G418筛选获得Mmp2稳转单克隆细胞株,并用Western blotting分析鉴定。用实时无标记细胞增殖分析技术(RTCA)分析Mmp2基因对肝癌细胞生长增殖的作用,细胞划痕愈合实验分析Mmp2基因对肝癌细胞迁移的作用。结果证明成功构建重组真核表达载体pEYFP-Mmp2,Western Blotting证实稳转株中高表达外源融合蛋白MMP2-YFP。细胞增殖和迁移结果表明,Mmp2基因可以抑制肝癌细胞增殖但能够促进肝癌细胞迁移。以上研究表明,Mmp2基因能够促进肝癌细胞迁移。     

CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶的序列分析与原核表达

目的对大肠埃希菌所产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）进行基因克隆和重组表达,探讨其特性。方法以产CTX-M-14型超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌12号菌总基因组DNA为模板,PCR扩增CTX-M-14,将其克隆入pUCm-T Vector载体后测定该核苷酸序列;再将基因编码区克隆到原核表达载体pET-28α,构建含CTX-M-14基因的重组表达质粒,转化到大肠埃希菌BL21中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳鉴定表达的酶蛋白后再过Ni-NTA柱纯化。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100％。大肠埃希菌BL21转化pET-28a／CTX-M-14重组质粒后,ESBLs试验为阳性。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,SDS-PAGE电泳显示蛋白分子质量大约为30KD。结论成功表达重组的CTX-M-14型酶,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础。     

内生多粘类芽胞杆菌纤溶酶基因PPFE-I在大肠杆菌中融合表达及活性分析

以内生多粘类芽胞杆菌EJS-3基因组DNA为模板,PCR扩增PPFE-I基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-PPFE-I,经测序正确后,将PPFE-I基因克隆至表达载体pET-DsbA上构建重组表达质粒pET-DsbA/PPFE-I,将其转化至E. coli BL21(DE3),在IPTG诱导下实现了融合蛋白DsbA-PPFE-I的表达,表达产物酶活性达228 IU/mL。表达产物用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。SDS-PAGE电泳检测表明融合蛋白主要以可溶形式表达,占菌体总蛋白的18.4％。Western blotting结果表明在相应分子量处有一条特异性条带,证实该蛋白为DsbA-PPFE-I融合蛋白。表达产物通过Ni亲和柱、凝血酶酶切及Sephadex G-100等步骤进行分离纯化,并用 MALDI-TOF 质谱对重组酶进行了鉴定。纯化后的表达产物在纤维蛋白平板上表现出明显的纤溶活性。     

人1型酪蛋白激酶的真核表达及其在肿瘤细胞中的定位

目的:构建带FLAG标签的人1型酪蛋白激酶(CK1)基因的真核表达载体,获得其表达产物,并研究该激酶在骨肉瘤U2OS、乳腺癌ZR-75-1、肝癌HepG2等多种肿瘤细胞中的表达及定位情况。方法:应用PCR技术从人乳腺文库中扩增人CK1基因的全长编码区,将其克隆到带FLAG标签的pCMV-Tag2B载体中;将重组质粒转染骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞,以SDS-PAGE和Western印迹鉴定表达情况;细胞免疫荧光观察FLAG-CK1质粒在骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞中的细胞定位。结果:双酶切和测序结果显示FLAG-CK1真核表达质粒构建成功;SDS-PAGE和Western印迹结果表明,FLAG-CK1转染骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞后成功表达;细胞免疫荧光实验显示,CK1在骨肉瘤U2OS细胞、乳腺癌ZR-75-1细胞、肝癌HepG2细胞的胞核和胞质中均有分布,且胞核信号强于胞质。结论:构建了CK1的真核表达载体,且FLAG-CK1能在不同肿瘤细胞系的细胞核和细胞质中表达,为进一步研究CK1对细胞的调控奠定了实验基础。     

鼻咽癌侯选抑瘤基因BRD7原核表达载体的构建及其表达

BRD7基因是一个鼻咽癌侯选抑瘤基因,为了构建BRD7基因的原核表达载体并使其在大肠杆菌得到表达,设计了带有SalⅠ,NotⅠ酶切位点的引物,以已构建好的质粒pGEM-T Easy/BRD7为模板,用PCR扩增出BRD7基因的完整阅读框架,并用SalⅠ,NotⅠ酶切PCR产物和原核表达载体PGEX-4T-2,然后用T4 DNA连接酶将其连接,得到重组表达质粒PGEX-4T-2/BRD7,经双酶切鉴定和测序验证,表达载体构建正确.重组表达质粒转化感受态大肠杆菌Jm105后用IPTG诱导,成功表达了一分子质量约为90 ku的融合蛋白;37℃诱导4 h后,SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳后,经扫描分析该融合蛋白产量占菌体蛋白总量28.48%, 蛋白质印迹(Western-blot)证实了该融合蛋白的表达获得成功.这为BRD7基因的蛋白纯化及抗体制备,进一步开展其功能研究奠定了基础.     

人铜锌超氧化物歧化酶cDNA的克隆,测序及表达

用逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）,以人胎肝组织总ＲＮＡ为模板,扩增了人铜锌超氧化物歧化酶（ｈＣｕ,ＺｎＳＯＤ）的ｃＤＮＡ,并进行序列分析,将该ｈＣｕ,ＺｎＳＯＤｃＤＮＡ重组到Ｔ７启动子控制下的分泌型表达载体ｐＥＴ２２ｂ（＋）中,构建表达质粒ｐＥＴＳＯＤ,并转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）。ＳＤＳＰＡＧＥ及蛋白质印迹分析表明,经１ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基硫代βＤ半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导后,可高效表达一分子量为１９ｋＤ的蛋白质,与抗人ＳＯＤ多抗有特异的免疫反应,表达量约为菌体总蛋白质的３０％,具有特异性ＳＯＤ酶活性,酶活力可达１７９７ｕ／ｍｌ培基。     

人CXCL9重组腺病毒的制备及其表达产物生物活性检测

目的构建携带人CXCL9基因的重组腺病毒,分析其表达产物的生物学活性。方法采用PCR法从pBLAST2-hCXCL9质粒上扩增出hCXCL9基因,再将其克隆至pENTR11载体上,构建pENTR11-hCXCL9质粒,通过同源重组将hCXCL9基因片段重组至pAd/CMV/V5-DEST上,最后在293A细胞内进行包装、扩增后得到携带hCX-CL9基因的重组腺病毒。用包装好的病毒感染Hela细胞,分析目的基因的表达及其生物学活性。结果成功地将hCXCL9基因片段克隆至重组腺病毒载体上,并经293A细胞包装出病毒颗粒。该病毒感染Hela细胞后,可在培养上清液中检测到显著表达的hCXCL9。通过趋化活性分析发现,该表达产物对T淋巴细胞具有明显的趋化活性。结论成功构建了hCXCL9重组腺病毒,并可在体外高效表达具有生物活性的目的产物。