水稻条纹病毒中国分离物和日本分离物RNA2节段序列比较

测定了来源于我国水稻条纹叶枯病常年流行区的云南楚雄(CX)及病害暴发区的江苏洪泽(HZ)的水稻条纹病毒(RSV)2个分离物RNA2全长序列,其长度分别为3506bp和3514 bp.与已报道的日本T和O分离物RNA2序列进行比较的结果表明,这4个分离物可分为两组,其中,HZ、T和O分离物为一组,组内分离物之间,RNA2的毒义链(vRNA2)及RNA2的毒义互补链(vcRNA2)上的ORF的核苷酸一致性分别为97.2%～98.0%和96.8%～97.1%,5′端和3′端非编码区的序列则完全一致.但HZ分离物与T分离物的亲缘关系更为密切,其基因间隔区(IR)与T和O分离物的等长.另一组为我国CX分离物,组与组之间,vRNA2及vcRNA2上的ORF的核苷酸一致性分别为95.0%～95.7%和93.9%～94.4%.CX分离物的IR与HZ分离物相比缺失了一段8 nt的片段.5′端非编码区的序列完全一致,但3′末端非编码区有一个碱基的差异.这些结果表明,RSV在自然界的分子变异与其地理分布具有密切的关系.此外,非编码区序列的高度保守性暗示着它们在病毒基因转录和复制的调控方面具有重要的功能.本文还讨论了RSV的分子流行病学.     

我国水稻条纹病毒一个强致病性分离物的RNA4序列测定与分析

对我国水稻条纹病毒(Rice Stripe Virus,RSV)一个强致病性分离物(辽宁PJ分离物)的RNA4区段进行扩增、克隆和测序,其核苷酸序列全长2157bp。与已报道的日本T和M分离物及我国云南CX分离物的RNA4序列进行比较分析,结果表明,这4个分离物可分为两组,其中,PJ、T和M分离物为一组,组内分离物之间,RNA4的毒义链(vRNA4)及RNA4的毒义互补链(vcRNA4)上的ORF的核苷酸一致性分别为970%和970%～975%,5′末端和3′末端非编码区的序列则完全一致。但PJ分离物与T分离物的亲缘关系更为密切,其基因间隔区(IR)与T分离物的等长,核苷酸一致性为930%,比M分离物的IR多了一段长19bp的插入序列,核苷酸一致性仅为850%。另一组为我国CX分离物,组与组之间,vRNA4及vcRNA4上的ORF的核苷酸一致性分别为940%和925%～935%,但在氨基酸水平上则没有明显的差异。CX分离物的IR与PJ分离物相比有一段长84bp的插入序列,组间,IR的核苷酸一致性仅为720%～750%,5′末端非编码区的序列完全一致,但3′末端非编码区有两个碱基的差异。这些结果表明,RSV在自然界的分子变异与其地理分布具有密切的关系。此外,非编码区序列的高度保守性暗示着它们在病毒基因转录和复制的调控方面具有重要的功能。本文还讨论了RSV的分子流行学。     

水稻条纹病毒两个分离物RNA4基因间隔区的序列比较

通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增了我国水稻秫纹病毒（ＲＳＶ）山东济宁（ＪＮ）、云南宜良（ＹＬ）两个分离物ＲＮＡ４基因间隔区（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎ,ＩＲ）序列,并克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ ｅａｓｙ载体上。序列分析结果表明：ＪＮ、ＹＬ两分离物ＲＮＡ４ ＩＲ均由６５４个核苷酸组成,两者之间的同源率为９２％。ＪＮ、ＹＬ两个分离物ＲＮＡ４ ＩＲ在ＡＵ碱基富集处可形成上明显的结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹     

水稻条纹病毒两个分离物RNA4基因间隔区的序列比较

通过RT-PCR扩增了我国水稻条纹病毒(RSV)山东济宁(JN)、云南宜良(YL)两个分离物RNA4基因间隔区(intergenic region,IR)序列,并克隆于pGEM-T easy载体上.序列分析结果表明:JN、YL两分离物RNA4 IR均由654个核苷酸组成,两者之间的同源率为92%.JN、YL两个分离物RNA4 IR在AU碱基富集处可形成两个明显的发夹结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹结构稳定;但另一个由于碱基变异导致所形成的发夹结构的稳定性在各个分离物中差异较大.这些结果说明了我国水稻条纹病毒存在明显的分子变异.     

水稻条纹病毒RNA4基因间隔区的分子变异

应用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）和单链构象多态性（single-strand conformation polymorphism,SSCP)技术快速检测我国水稻条纹病毒（RSV）RNA4基因间隔区（intergenic region,IR)的分子变异,结果表明,我国RSV RNA4 IR存在分子变异。供试的7个分离物共有4种泳动带型,其中YL、BS、JD、LY分离物完全一致,而YL、BS、YL及JD4个分离物序列完全一致;JN、PJ、SQ3个分离各不一样,序列之间的同源性均在92％－94％之间.IR序列内部具有两个重要的结构特征：（1）有两处反向重复序列,可形成两个明显的发夹结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹结构稳定;但中一个发夹结构由于碱基变异导致其稳定性在各个分离物中差异较大;（2）具有插入序列,相对于日本M分离物,我国7个分离物都有一段长19bp的插入序列,这段插入序列比较保守,各分离物之间仅有1－2个碱基的差异。     

我国水稻条纹病毒RNA3片段序列分析—纤细病毒属重配的又一证据

测定了来源于我国水稻条纹叶枯病常年流行区的辽宁盘锦 (PJ)、云南昆明 (KM)、云南宜良 (YL)及病害暴发区的江苏洪泽 (HZ)的水稻条纹病毒 (RSV) 4个分离物RNA3全长序列 ,其长度分别为 2 480bp、2 5 0 9bp、2 489bp和 2 497bp。与已报道的RSV云南Y、日本T和M分离物RNA3序列进行比较的结果表明 ,这 7个分离物可分为两组 ,其中 ,KM、YL分离物为一组 ,PJ、HZ、Y、T和M分离物为另一组。组与组之间 ,RNA3的毒义链 (vRNA3)及RNA3的毒义互补链 (vcRNA3)上的ORF的核苷酸同源性分别为 97%～ 98%和 93%～ 94% ,但在氨基酸水平上则没有明显差异。结合上述RSV分离物RNA4的核苷酸全序列比较结果 ,推测认为RSV自然种群中存在两个与地理因素相关的不同类型的亚群 ,Y分离物不同片段具有不同来源可能是由重配引起的。     

水稻条纹病毒RNA4基因间隔区序列分析——混合侵染及基因组变异证据

克隆和测定了我国水稻条纹病毒（RSV）22个分离物 RNA4基因间隔区（Intergenic region,IR）序列,序列比较结果表明,我国RSV RNA4 IR在长度上存在634bp、654bp及732bp 3种不同的类型,其中3种不同类型的序列在云南省均有存在,而在其它省份仅存在654bp 类型的序列,云南省还存在不同片段类型序列在同一分离物中混合侵染的现象。序列内部具有两个重要的结构特征,一是具有插入序列;二是有两处反向重复序列,可形成两个明显的发夹结构,其中一个序列比较保守,形成的发夹结构稳定;但另一个发夹结构由于碱基变异导致其稳定性在各个分离物中差异较大。本论文还讨论了插入片段特性、不稳定的发夹结构的形成最低自由能及病毒致病性分化的关系。     

大麦条纹花叶病毒新疆分离物是三组分RNA病毒

大麦条纹花叶病毒新疆分离物(BSMV-XJ)的RNA在乙二醛,二甲亚砜中进行变性电泳,电泳图谱可重复的显示三个组分。将电泳分离的BSMV-RNA各组分在高盐浓度下吸附转移到硝酸纤维素薄膜上,经固定后,与~(32)P标记的病毒总RNA的cDNA行分子杂交。在X光放射自显影图谱上,进一步证实BSMV-XJ为三组分RNA病毒。本文同时就BSMV-RNA不经变性电泳也可以部分吸附转移到硝酸纤维素薄膜上的现象讨论了可能的分子基础。     

甜菜坏死黄脉病毒内蒙分离物RNA3序列分析及编码25kD蛋白基因在大 …

以甜菜坏死黄脉病毒（ＢＮＹＶＶ）内蒙分离物的总ＲＮＡ为模板,通过反转录－－ＰＣＲ扩增获得ＢＮＹＶＶＲＮＡ３全长ｃＤＮＡ。将其克隆到ＰＥＭ－７Ｚｆ上,得到重组质粒ｐＧＢＹ５６。序列分析结果表明,内蒙分离物ＲＮＡ３基因组全长 １７７５ｎｔ     

水稻条纹病毒胁迫下的水稻全基因组表达谱

水稻条纹叶枯病由水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)引起,对我国水稻生产危害严重.为了明确RSV侵染对水稻基因表达谱的影响,采用Affymetrix水稻全基因组芯片对RSV接种后出现条纹症状第7天的武育粳3号水稻病叶和相应的健康叶片进行了全基因组表达谱分析,得到3 517个差异基因,其中2 002个表达上调,1 515个表达下调.根据TIGR数据库注释(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)和MIPS基因功能分类标准(http://mips.gsf.de/projects/funcat)将差异基因归类为15个功能类别,多数差异基因与植物防御、信号传导及蛋白质、碳水化合物的代谢相关,一些转录因子的表达也发生了明显的变化.代谢途径分析表明,RSV侵染后磷酸戊糖途径、类黄酮合成途径和芸苔素合成途径的相关基因表达明显增强,赤霉素合成途径相关基因的表达受到了抑制.     

水稻条叶枯病毒NS2基因遗传多样性分析

应用单链构象多态性 (SSCP)和序列分析方法研究了来自我国 9个省份的水稻条叶枯病毒(RSV) 80个田间分离物的NS2基因遗传结构特征 .SSCP分析结果表明 ,我国RSVNS2基因遗传结构符合准种 (quasispecies)结构特征 .部分分离物的序列分析结果表明 ,RSV上述分离物和已报道的日本 2个分离物可以归入 2个组 :云南的部分分离物划分为 1个组 ;其它分离物及日本T、O的 2个分离物为另 1组 .组与组之间 ,NS2蛋白基因核苷酸同源性为 94 %～ 95 % ,氨基酸同源性为 95 %～ 97% .遗传多样性分析结果表明 ,RSV种群存在地理隔离但在种群间可能发生了基因漂移 (geneflow) .NS2蛋白可能的运动蛋白功能所造成的负选择压力和介体传播引起的奠基者效应可能是RSV种群内和种群间遗传多样性差别的主要因素     

我国水稻条纹叶枯病病原性质的研究

病样经提纯后,在电镜下获得3nm丝状和8nm分枝丝状结构,病毒样在蔗糖密度梯度离心后产生三条沉降带。经过电泳分析表明:病毒外壳蛋白为单一组分,分子量约为3.69×10~4dalton;病毒核酸有三种大小不同的组分,分子量为0.9,1.0,1.4×100dalton(混合样)。用提纯的抗原制备抗血清。提纯病毒抗原与所制备抗血清、与我国过去研究制备的抗血清及与日本制备的条纹叶枯病单克隆抗体都有血清学反应。     

抗水稻条纹叶枯病毒核酶的设计,克隆及体外活性测定

为探索控制水稻条纹叶枯病毒（Ｒｉｃｅｓｔｒｉｐｅｖｉｒｕｓ,ＲＳＶ）设计合成了特异切割该病毒ＲＮＡ保守区及编码病害特异性蛋白（ＤｉｓｅａｓｅＳｐｅｃｉｆｉｃＰｒｏｔｅｉｎ,ＤＳＰ）基因的核酶,核酶基因的长度均为４０个碱基,用化学合成方法合成其正链及与其３＇－末端互补的１５个碱基引物,用ＴａｇＤＮＡ多聚酶合成其互补链。双链ＤＮＡ直接插入克隆载体ＰＧＥＭ３ｚｆ（＋）的Ｓｍａｌ位点。序列测定表明,克隆得到的核酶序列与设计的核酶序列完全一致。经ＳＰ６ＲＮＡ多聚酶体外转录得到核酶ＲＮＡ。当核酶ＲＮＡ与以同样方法转录得到的靶基因ＲＮＡ混合反应,可得到预期结果相同的切割片段,表明两种核酶在体外均具有特异性切割活性。     

水稻条纹病毒蛋白与核酸的特性

提纯的水稻条纹病毒(云南宜良分离物)在电镜下的形态为多型性,但主要是宽8-10 nm,长80-250的分枝丝状体,有些为直径3 nm或8 nm的开环环状体,有些为13 nm宽,130-190 nm长的丝状体,但其基本结构应是直径3 nm、长度不等的丝状体.经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,vRNA4编码的病害特异蛋白(SP)分子量为19.9 kDa,而vcRNA3编码的外壳蛋白(CP)约为33.6 kDa.在非变性条件下,RSV的4条ssRNAs大小分别为3.0×106(ssRNA1)、1.2×106(ssRNA2)、0.9×106(ssRNA3)和0.8×106 Da(ssRNA4),有时出现一条大小为0.58×106 Da的单链RNA(ssRNA5);而4条dsRNAs的分子量分别为4.9×106(dsRNA1)、2.8×106(dsRNA2)、2.0×106(dsRNA3)和1.7×106 Da(dsRNA4).利用制备电泳分离提纯的外壳蛋白免疫家兔,得到了高特异性的抗血清.A蛋白夹心ELISA检测结果表明,RSV-CP与水稻草状矮化病毒(RGSV)CP抗血清有微弱的反应,但与RSV、RGSV的SP抗血清没有反应,而RSV-CP抗血清与RSV-SP及RGSV的SP、CP都无血清学关系,这个结果表明RGSV与RSV之间在进化上具有一定的亲缘关系.