乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1 203bp.克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型.有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点.然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal I线性化的pPIC9K-preS质粒用电击法导入巴斯德-毕赤酵母GS115His-中.通过MD-G418平板筛选和5'AOX1和3'AOX1引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长preS基因的His+Mut+酵母工程菌株.此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长PreS蛋白并可分泌到培养液中,SDS-PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的PreS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应.     

乙型肝炎病毒PreS2S基因在毕赤酵母中表达的研究

构建重组质粒PHIL-D2/PreS2S以研究乙肝病毒PreS2(120-146)S基因编码蛋白在毕赤酵母中的表达。通过PCR扩增获得PreS2S片段,插入含AOX1启动子的Pichia Pastoris表达载体PHIL-D2中,构建重组表达质粒PHIL-D2/PreS2S,转化酵母宿主菌GS115。挑取阳性克隆摇床培养,甲醇诱导表达。通过ELISA、RPHA鉴定表达产物。成功构建了PHIL-D2/PreS2S真核表达载体,经过序列分析,插入的基因为在中国流行的adr亚型。在毕赤酵母中重组载体表达了S蛋白,S蛋白的表达量为34.9 mg/L,PreS2抗原检测为强阳性。利用毕赤酵母表达系统能够有效地表达乙型肝炎病毒的PreS2S蛋白,PreS2S蛋白具有良好的生物学活性。     

乙型肝炎病毒包膜M蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

转化了乙肝病毒 preS2 S基因的重组巴斯德毕赤酵母菌株经甘油培养基充分增殖 ,然后转移到甲醇培养基中进行诱导表达。破碎细胞并提取胞内蛋白 ,经ELISA和WesternBlot检测 ,证明有 4株GS1 1 5 /HIS MUT 表达了HBVM蛋白。     

乙型肝炎病毒包膜M蛋白在巴斯德毕德毕赤酵母中的表达

转化了乙肝病毒ｐｒｅＳ２－２基因的重组巴斯德毕赤酵母菌株经甘油培养基充分增殖,然后转移到甲醇培养基中进行诱导表达,破碎细胞并提胞内蛋白,经ＥＬＩＳＡ和ＷｅｓｔｅｎＢｌｏｔ检测证明有４株ＧＳ１１５／ＨＩ＾＋ＭＵＴ＾＋表达了ＨＢＶ Ｍ蛋白。     

乙型肝炎病毒表面抗原preS2+S基因在Pichia Pastoris酵母系统的分泌表达

拟获得adw2亚型乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原preS2 S基因在PichiaPastor妇酵母分泌型表达系统(pPIC9K)的高效表达。实验首先将adw2亚型乙肝病毒表面抗原preS2 S基因重组到分泌型酵母表达载体(pPIC9K)形成表达质粒,电转化酵母细胞：KM71,G418筛选多拷贝整合克隆。经甲醇诱导表达并用SDS-PAGE电泳及酶免疫法检测表达产物。经100个克隆筛选获得了表达量较高的表达菌株WC4。该菌株甲醇诱导后细胞上清10倍浓缩SDS—PAGE电泳检测显示,细胞上清中有特异蛋白条带,且第6天表达量最高, 表达产物单体分子量为31kD左右。用美国雅培公司AUZYME MONOCLONAL试剂盒估算表达量为2μg／100OD600细胞。上述结果表明,乙肝病毒表面抗原preS2 S基因在本系统中获得了分泌表达。同时检测了酵母细胞裂解液中特异蛋白质的表达,结果发现,自甲醇诱导后第一天即可检测到表达产物,而且除了第6天细胞外表达量高于细胞内外,其余各天的表达水平均表现为细胞内高于细胞外。以上结果提示,利用分泌型酵母表达系统表达乙肝病毒表面抗原在技术上可行,但表达产量偏低,一些蛋白滞留在细胞内未能分泌到培养基中。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白,为探讨HBVX蛋白与慢性乙型肝炎及肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法：用PCR方法扩增X基因序列,并分别在上下游引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,插入pPICZαA载体,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切及测序鉴定,构建HBVX蛋白毕赤酵母表达质粒pPICZαA-HBx;电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和465bp的片段,表明目的片段已插入载体中,序列测定表明其含有完整的X基因片段,Western blotting结果显示含有pPICZαA-HBx的毕赤酵母GS115能分泌表达X蛋白。结论：构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-HBx,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达X蛋白。     

带有PreS的重组乙肝表面抗原在毕赤酵母中的表达

带有ＰｒｅＳ区的乙肝表面抗原（ＨＢｓＡｇ）有望成为新一代更高效的乙肝疫苗。利用毕赤属酵母（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）表达系统,表达了带有ＰｒｅＳ区免疫决定簇的理组乙肝表面抗原Ｓ１Ｓ、ＳＳ１和Ｓ２Ｓ。对表达产物的性质鉴定表明,产物可以形成２具有相应的Ｓ、ＰｒｅＳ１或ＰｒｅＳ２抗原性的颗粒,表达水平高于啤酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）表达系统。     

乙型肝炎病毒表面抗原在乳酸克鲁维酵母中的表达

将乙型肝炎表面抗原基因插入具调控型启动子PH05的乳酸克鲁维酵母表达载体中,构建完成质粒pLSl．转化宿主菌Kluyveromyces lactis CXJ1—7A,ELISA结果表明．其表达水平受无机磷浓度的调控。为了进一步提高表达水平,我们将Pls1中的乙型肝炎表面抗原表达单元插入带完整Pkd1序列的载体Pe1,并将构建成的质粒Pls2转化MW98—8C。在比较了CXJ-7A／Pls1和MW98—8c／Pls2后,我们发现MW98—8c／Pls2的稳定性大大提高．表达量也增加4～8倍。     

丙型肝炎病毒核心蛋白在大肠杆菌和毕赤酵母中表达的比较

为获得丙型肝炎病毒的核心蛋白（Core）,将克隆有Core基因的表达载体pBVIL1-Core转化大肠杆菌HB101,温度诱导表达Core蛋白。同时利用PCR方法以含有丙型肝炎病毒全基因的质粒PBR^TM／HCV为模板扩增Core基因,克隆进表达载体pPICZαA,构建表达载体pPICZαA-Core,转化毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115,在甲醇诱导下表达Core蛋白。Western-blot显示Core蛋白在大肠杆菌中高效表达,表达蛋白量占菌体总蛋白的20％;在酵母培养上清中存在Core蛋白,证明Core蛋白在酵母系统中成功表达。     

毕赤酵母表达系统在外源蛋白表达中的研究及应用

巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统作为一个日臻完善的外源蛋白真核表达系统由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的优势而得到越来越广泛的应用。分别从该表达系统的优点、外源基因整合及调控机理、表达蛋白糖基化及翻译后修饰等方面综述了其在外源蛋白表达中的研究进展及应用。     

巴斯德毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展

巴斯德毕赤酵母是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统。分别从的菌株、载体、外源基因整合、表达产物糖基化和外源基因高效表达等方面综述了毕赤酵母表达系统的研究进展。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。     

山羊重组促卵泡素长效类似物基因在毕赤酵母中表达

为了获得长效FSH制剂, 利用重叠PCR技术将山羊FSH的a, b亚单位, 通过hCGb亚单位羧基末端延长肽(CTP)基因序列的连接, 构建成单链长效类似物基因FSHb-CTP-a。将其克隆至表达载体pPIC9K, 重组载体线性化处理后电转化至毕赤酵母GS115中, 经判型和G418筛选后获得高拷贝菌株His+Mut+。经甲醇诱导表达后, 进行SDS-PAGE和Western blot分析表明: 重组FSHb-CTP-a的转化子可以正确有效地表达目的蛋白, 分子量约为29 kD。放射免疫分析法(RIA)测定表达上清, 高拷贝转化子的平均表达量为91.849 mIU/mL, 显著高于低拷贝转化子的平均37.419 mIU/mL的表达量, 为FSH的结构研究和长效FSH制剂的生产奠定了基础。     

山羊重组促卵泡素长效类似物基因在毕赤酵母中表达

为了获得长效FSH制剂, 利用重叠PCR技术将山羊FSH的a, b亚单位, 通过hCGb亚单位羧基末端延长肽(CTP)基因序列的连接, 构建成单链长效类似物基因FSHb-CTP-a。将其克隆至表达载体pPIC9K, 重组载体线性化处理后电转化至毕赤酵母GS115中, 经判型和G418筛选后获得高拷贝菌株His+Mut+。经甲醇诱导表达后, 进行SDS-PAGE和Western blot分析表明: 重组FSHb-CTP-a的转化子可以正确有效地表达目的蛋白, 分子量约为29 kD。放射免疫分析法(RIA)测定表达上清, 高拷贝转化子的平均表达量为91.849 mIU/mL, 显著高于低拷贝转化子的平均37.419 mIU/mL的表达量, 为FSH的结构研究和长效FSH制剂的生产奠定了基础。     

辣根过氧化物酶同功酶C3基因在毕赤酵母中的表达

目的：克隆与表达辣根过氧化物酶同功酶C3（HRPC3）基因。方法：用PCR方法从辣根的总DNA中,扩增得到一种辣根过氧化物酶同功酶C3基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上,测序证明正确后,再将目的基因正确插入到巴斯德毕赤酶母表达载体pPIC9K中,含有目的基因的重组pPIC9K质粒在毕赤酶母中进行表达与分析。结果：应用毕赤酶母作为受体菌,成功表达了HRPC3基因,其活性为56IU/L。结论：毕赤酶母直接表达出了具有生物活性的辣根过氧化物酶同功酶C3。     

一个推测的拟南芥漆酶基因在巴斯德毕赤酵母中的表达

At5g01040基因是一个推测的拟南芥漆酶基因。根据其编码序列设计引物,利用RT—PCR方法扩增出1755bp的片段。测序结果表明,该片段存在3个突变位点,其中一个突变位点改变了所编码的氨基酸。将该片段克隆到表达载体pPICZaB上,电击转化毕赤酵母。经筛选获得80个候选重组菌株,其中18个菌株的培养液中存在漆酶活性,说明所克隆的基因在毕赤酵母中实现了分泌表达,证实了At5g01040编码的蛋白具有漆酶活性。