脱硫创新霉素对邻氨基苯甲酸合成酶活性的影响

<正> 用两种实验方法观察了脱硫创新霉素对ASase活性的影响。1.药物对E.coli BT36(Trp~- phe~- tyr~-)积累邻氨基苯甲酸的影响。发现脱硫创新霉素虽然部分抑制邻氨基苯甲酸的积累,却不出现分支酸的积累,而色氨酸在抑制邻氨基苯甲酸积累的同时出现分支酸积累。2.药物对ASase的作用。发现税硫创新霉素和创新霉素均不能抑制ASase活性,而色氨酸能显著抑制ASase活性,从而证明了脱硫创新霉素和创新霉素的抗菌作用不是通过反馈抑制色氨酸途径第一酶ASase的活性而实现的。     

脱硫创新霉素对E.coli B的抗菌作用和抗菌原发作用

<正> 脱硫创新霉素是我所合成室用创新霉素进行脱硫反应制备的一个创新霉素衍生物,其分子结构为β—甲基吲哚丙酸。脱硫创新霉素虽然不具有创新霉素的噻喃环,但是实验结果说明:1.脱硫创新霉素对E.colib的抗菌作用与创新霉素相似。2.色氨酸能够恢复脱硫创新霉素对E.coli B的生长抑制作用和脱硫创新霉素对E.coli BT(Trp~-)的生长无抑制作用。这说明脱硫创新霉素的抗菌原发作用也和创新霉素一样是抑制色氨酸的生物合成。     

头状轮生链霉菌芳香族氨基酸合成途径的调节

对头状轮生链霉菌(Streptoverticillium caespitosus)芳香氨基酸合成途径的研究表明,第一个酶即3—脱氧—α—阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)合成酶无同工酶,不被L-色氨酸阻遏,比活力可被硝酸盐促进。L-色氨酸强烈地反馈抑制此酶,L-酪氨酸和L-苯丙氨酸无作用。L-色氨酸的反馈抑制对磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是非竞争性的,K_I为373μmol/L。酶对PEP和4-磷酸亦藓糖(E4P)的K_m值分别为50和100μmol/L。PEP和C0²⁺对酶有稳定作用。邻氨基苯甲酸合成酶活力可被1mmol/L L-色氨酸完全抑制,此酶也受L-色氨酸的阻遏,但是色氨酸支路上其余4个酶不被阻遏。分支酸变位酶被L-酪氨酸抑制。L-苯丙氨酸抑制预苯酸脱水酶,并更强地抑制预苯酸脱氢酶。     

大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控

为了通过基因工程手段提高大肠杆菌色氨酸产量, 对色氨酸生物合成途径中的关键基因trpR、tnaA、aroG和trpED进行了改造。首先通过敲除trpR基因解除了基因组上色氨酸合成和转运关键酶受到的反馈阻遏调控, 进而又敲除了tnaA基因, 阻断了色氨酸的分解代谢。然后, 将色氨酸合成途径的关键酶aroGfbr和trpEDfbr基因串联表达, 以去除色氨酸生物合成途径的瓶颈。与对照MG1655相比, trpR基因单敲菌色氨酸浓度提高了10倍, 双敲菌色氨酸浓度提高了约20倍。pZE12-trpEDfbr转入双敲菌后色氨酸浓度提高到168 mg/L, 而将aroGfbr和trpEDfbr转入双敲菌后, 色氨酸浓度提高到820 mg/L。为构建色氨酸高产菌奠定了基础。     

大肠杆菌色氨酸生物合成途径关键酶的调控

为了通过基因工程手段提高大肠杆菌色氨酸产量, 对色氨酸生物合成途径中的关键基因trpR、tnaA、aroG和trpED进行了改造.首先通过敲除trpR基因解除了基因组上色氨酸合成和转运关键酶受到的反馈阻遏调控, 进而又敲除了tnaA基因, 阻断了色氨酸的分解代谢.然后, 将色氨酸合成途径的关键酶aroGfbr和trpEDfbr基因串联表达, 以去除色氨酸生物合成途径的瓶颈.与对照MG1655相比, trpR基因单敲菌色氨酸浓度提高了10倍, 双敲菌色氨酸浓度提高了约20倍.pZE12-trpEDfbr转入双敲菌后色氨酸浓度提高到168 mg/L, 而将aroGfbr和trpEDfbr转入双敲菌后, 色氨酸浓度提高到820 mg/L.为构建色氨酸高产菌奠定了基础.     

芳香途径终产物和中间体对力复霉素SV生物合成的调节作用

本文报道了芳香化合物对力复霉素生物合成和芳香途径开始的DAHP合成酶活力的调节作用。首先,洗涤菌体实验结果指出,色氨酸对力复霉素sV合成有明显抑制,苯丙氨酸和酪氨酸本身作用不明显。其次,酶活力测定结果表明,色氨酸抑制力复霉素生物合成是由于它对DAHP合成酶的反馈抑制;同时,在无细胞抽出液中酪氨酸和苯丙氨酸对色氨酸抑制也显示了协同作用。此外,力复霉素芳香前体(C7N)的结构类似物对氨基苯甲酸和对羟基苯甲酸对抗生素合成也有影响,主要影响c,N的生物合成。     

色氨酸操纵子研究进展

色氨酸只能由微生物和植物合成。催化色氨酸分支途径的酶由色氨酸操纵子编码。生物体内色氨酸合成受到严格调控,色氨酸操纵子发挥重要作用。本文综述色氨酸代谢途径及其调节,并对途径工程在色氨酸操纵子改造中的应用进行回顾。     

利用大肠杆菌细胞工厂生产吲哚-3-乙酸的研究

目的:利用重组大肠杆菌全细胞转化色氨酸生产IAA.方法:在大肠杆菌胞内构建两条全新的IAA合成途径,即吲哚-3-乙酰胺(indole-3-acetamide,IAM)途径和色胺(tryptamine,TRP)途径.结果:IAM途径涉及两个酶,分别是色氨酸-2-单加氧酶(IAAM)和酰胺酶(AMI1),构建好的重组大肠杆...     

生淀粉糖化酶催化位点氨基酸及酶合成调控的初步研究

通过对Rhizopus OR-1UVN菌种所产生淀粉糖化酶在不同底物不同缓冲溶液条件下酶最适pH的测定,推测出该生淀粉糖化酶活力中心催化位点氨基酸是天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)。实验证明5～50mg/mL浓度葡萄糖对生淀粉糖化酶没有抑制作用。分别以浓度<5mg/mL葡萄糖和淀粉为碳源的培养基进行不同碳源发酵实验,发现以淀粉为碳源的培养基Ⅰ发酵15h开始产生淀粉糖化酶,以葡萄糖为碳源的培养基Ⅱ发酵35h开始产酶(葡萄糖浓度<8mg/mL),而且前者菌体较后者少,由此可知葡萄糖对产酶有阻遏作用。实验还发现解阻遏熟淀粉糖化酶的葡萄糖浓度(15mg/mL)比生淀粉糖化酶的要高。由于葡萄糖的阻遏作用不发生在翻译水平,而发生在转录水平上,而且生淀粉糖化酶(G1)与熟淀粉糖化酶(G2)来自同一条DNA链,可以推测存在mRNA的拼接。通过以生淀粉为碳源的比较实验,发现生淀粉对生淀粉糖化酶形成的诱导作用可能主要是通过mRNA拼接的调节来实现的。     

鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成的调控研究：VI.超阴遏突变体的分离和遗传 …

从鼠伤寒沙门氏菌的ＴＴ１２３０６（ｐｕｒＤ∷ｌａｃ）株出发,对８６个对数生长期培养物作了诱变处理,在Ｅ＋Ａｄｏ＋Ｘ－ｇａｌ平板上得到６６个独立的白色或浅蓝色菌落,经测定它们在阻遏和去阻遏条件下的β－半乳糖苷酶活性、回复突变频率、突变位点的转导分析和显性实验。证明其中１１株为嘌呤生物合成途径中的超阻遏突变体。     

鼠伤寒沙门氏菌嘌呤生物合成的调控研究 Ⅵ.超阻遏突变体的分离和遗传鉴定

从鼠伤寒沙门氏菌的ＴＴ１２３０６（ｐｕｒＤ∷ｌａｃ）株出发,对８６个对数生长期培养物作了诱变处理,在Ｅ＋Ａｄｏ＋Ｘｇａｌ平板上得到６６个独立的白色或浅蓝色菌落,经测定它们在阻遏和去阻遏条件下的β半乳糖苷酶活性、回复突变频率、突变位点的转导分析和显性实验,证明其中１１株为嘌呤生物合成途径中的超阻遏突变体。     

利用根癌农杆菌T-DNA 插入突变寻找参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因

【目的】新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)是人类重要致病真菌,主要毒性因子之一漆酶的表达受葡糖糖阻遏,机制未知。本文拟寻找参与葡萄糖阻遏的关键基因。【方法】建立根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumefanciens-mediated transformation,ATMT)建立一个容量约200000的随即插入突变文库,在高浓度葡萄糖条件下从中筛选葡萄糖去阻遏的突变株。通过Southern确定突变株中T-DNA的拷贝数,利用反向PCR获得依赖葡萄糖的漆酶阻遏基因序列。【结果】筛选到了30株葡萄糖去阻遏突变株,Southern blot发现83%的葡萄糖去抑制突变株含有单个T-DNA拷贝。初步鉴定了可能参与漆酶阻遏的10个不同生物学功能基因,如参与碳水化合物的代谢,固醇的合成,几丁质的合成,GPI脂锚钩的合成等等。【结论】ATMT突变策略可以找到一些参与漆酶葡萄糖阻遏的关键基因,为理解漆酶在致病过程中的作用机制和工业改进漆酶活性提供参考。     

模块化工程改造大肠杆菌生产L-色氨酸

L-色氨酸作为一种必需氨基酸,广泛应用于食品、饲料和医药等领域。目前,微生物法生产L-色氨酸存在转化率低等问题。为此,本研究通过敲除L-色氨酸操纵子阻遏蛋白(L-tryptophan operon repressor protein, trpR)、替换l-色氨酸弱化子(trpL)、引入抗反馈调节的aroG^fbr等,获得可积累11.80 g/L L-色氨酸的底盘菌株大肠杆菌(Escherichia coli)TRP3。在此基础上,将L-色氨酸合成途径分为中心代谢途径模块、莽草酸(shikimic acid, SA)途径至分支酸(chorismic acid, CHA)模块、分支酸至L-色氨酸模块,并借助启动子工程,通过平衡中心代谢途径模块、莽草酸途径至分支酸模块、分支酸至L-色氨酸模块,获得工程菌E.coli TRP9。在5 L发酵罐中,工程菌E.coli TRP9的L-色氨酸产量提升至36.08 g/L,糖酸转化率提升至18.55%,达到理论转化率的81.7%。本研究利用模块工程策略,构建了高产L-色氨酸生产菌株,为l-色氨酸的规模化生产奠定了良好的基础。     

黄孢原毛平革菌抗营养阻遏产漆酶诱变育种及其产酶特性

【目的】筛选能抗营养阻遏产漆酶的黄孢原毛平革菌,论证其产漆酶的确定性及抗营养阻遏产木质素酶的可行性,为白腐菌产酶代谢调控、木质素降解机理的研究奠定基础。【方法】利用重复紫外诱变法,以愈创木酚富氮鉴别培养基筛选目标菌株;比较不同营养条件下菌体生长与产酶动力学差异研究产酶营养调控机理;通过热处理、排除锰离子和加入过氧化氢酶等不同措施论证黄孢原平毛平革菌能否产生漆酶。【结果】3种不同方法均证实选育到的pcR5305和pcR5324菌株在限氮与富氮条件下均能产生漆酶,pcR5305和pcR5324在限氮条件下产漆酶分别达到203.5、187.6 U/L;在富氮条件下为220.6、183.9 U/L,而原菌株pc530在两种条件下都基本不产生漆酶。二菌株产漆酶调控方式不同,pcR5305漆酶产生与菌体生长同步,而pcR5324漆酶产生却受营养氮阻遏。二菌株同时具有抗营养阻遏高产木质素过氧化物酶(LiP)和锰过氧化物酶(MnP)(分别为LiP 1343.2、MnP 252.2 U/L;LiP 1169.5、MnP 172.4 U/L)的能力。【结论】筛选到的黄孢原毛平革菌变异菌株能产漆酶,同时表现了抗营养阻遏产漆酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的能力,具有重要的生产应用与理论研究价值,为白腐菌产酶代谢调控机理研究提供了原始菌株并奠定了良好的基础。     

一株CX-DBT脱硫菌的筛选及发酵条件优化

【目的】从大型工业油田石油污染土样中分离鉴定一株能专一性脱除CX-DBT的脱硫菌株,分析其对CX-DBT的脱硫途径,并确定菌体最优发酵条件。【方法】以二苯并噻吩(DBT)为唯一硫源底物,多次富集并分离可代谢CX-DBT菌株,通过形态学、生理生化实验及16S rRNA基因序列分析对筛选菌株JDZX13进行鉴定。采用GC-MS鉴定菌株对CX-DBT的代谢产物,确定其相应的脱硫途径。通过单因素发酵实验确定最佳碳源、氮源、微量元素、MgCl_2、温度及p H的水平范围,并采用正交实验进一步优化。【结果】该菌株鉴定为戈登氏菌属,命名为戈登氏菌JDZX13(KP993297),其CX-DBT代谢途径为"4S途径"。最佳发酵条件为:蔗糖15.0 g/L、NH_4Cl_2.0 g/L、MgCl_2 0.1 g/L、微量元素1.0 m L/L、pH 7.0、温度35°C。【结论】获得一株通过"4S途径"代谢CX-DBT的脱硫菌株JDZX13,经过进一步优化实验,强化了菌株的生长和脱硫能力,该研究结果对石油生物脱硫技术的开发具有重要参考意义。     

色氨酸2,3-双加氧酶调控炎症免疫反应在疾病中的作用

犬尿氨酸代谢通路(kynurenine pathway,KP)是色氨酸代谢的主要途径,参与机体多个病理生理过程.色氨酸2,3-双加氧酶(tryptophan 2,3-dioxygenase,TDO2)是KP的初始限速酶之一,能够催化色氨酸(tryptophan,Trp)使其转化为犬尿氨酸(kynurenine,Kyn)...     

玉米黑粉菌DNA载体的构建和它的原生质球的转化和再生

我们用玉米黑粉菌(Ustilago maydis)热休克基因(Heat shock gene,hsp 70)的启动子和终止子与新霉素磷酸转移酶基因相连,构建成了有效的双功能质粒pDL1(在E。coli中用Amp作为选择标记,在玉米黑粉菌中用新霉素作为选择标记)。以分离的一株新霉素敏感的玉米黑粉菌作为受体菌,用构建的pDL1质粒作为供体DNA,对影响受体菌原生质球的形成条件(培养基、菌龄、各种酶、酶的浓度、作用时间和渗透压稳定剂)、再生条件和DNA转化条件进行了初步研究。对数前中期收集的菌体,以5mg/ml真菌溶壁酶处理30分钟左右,90%都形成原生质球,其再生率为60—80%,转化率为300—1000转化子/μg DNA。随机选出25个转化子,DNA杂交都为阳性。分析dot-blot和Southern blot DNA杂交结果,发现质粒在细胞中以整合形式存在,一个细胞可以有多拷贝的整合质粒,质粒可能以非完全同源性的重组形式,参入性地整合进染色体中。     

生物酶/γ-Al2O3小球催化氧化柴油脱硫性能研究

通过吸附法将生物酶负载在γ-Al₂O₃小球载体上,并对生物酶/γ-Al₂O₃及载体进行扫描电镜(SEM)、比表面积分析(BET)、傅里叶红外光谱(FT-IR)及圆二色谱(CD)表征。结果表明:生物酶被吸附在载体上。将制备的生物酶/γ-Al₂O₃催化真实柴油氧化脱硫,考察了反应温度、反应流速和酶溶液浓度对真实柴油脱硫效果的影响,并对脱硫效果进行定性及定量分析;进一步对脱硫工艺条件进行响应面设计优化,找出最优反应条件。实验结果显示:反应温度49℃、反应流速1.0 mL/min、酶溶液浓度15.5%(酶载量为28.13 g),得出的最优脱硫率为93.16%;最后考察了该固定化酶的重复使用性能,该催化剂使用7次活性无明显降低,表明该固定化酶催化氧化柴油脱硫效果显著,具有潜在的工艺应用价值。     

转录的阻遏作用与衰减作用的不同

衰减作用是细菌辅助阻遏作用的一种精细调控,虽然它们都是调节基因转录,但是两种不同类型的调控方式,它们之间有着许多不同点。以色氨酸操纵子转录的阻遏作用和衰减作用为例,它们的区别归纳起来有如下方面。（1）调控的信号不同阻遏作用的信号物质是Trp;而衰减作用的信号物质严格说来应是TrP－tRNA,因为当氨酰-tRNA合成酶缺损时,TrP的积累不会引起转录的衰减作用。（2）调控的关键不同阻遏作用的关键是阻遏蛋白与信号物质Trp的相互作用;而衰减作用的关键是转录与翻择相偶联。（3）调控的分子基础不同阻遏作用的分子基础是阻遏…     

乳糖发酵短杆菌色氨酸营养缺陷株的诱变*

用亚硝基胍(NTG)诱变乳糖发酵短杆菌(Breevibacterium lactofermentum)ATCC-13869得到34株氨基酸营养缺陷突变株。经添加生物合成代谢途径中的不同底物鉴定,突变株33为色氨酸酶基因(tnA)缺陷,突变株34为色氨酸合成酶基因(trpB trpA)缺陷。