CREG低表达饲养层STO细胞的建立

目的:为阐明E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)对胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)自我更新的影响及作用机制,本研究拟通过RNA干扰方法建立CREG低表达的饲养层STO细胞,为深入研究奠定基础。方法:用Western Blot方法检测饲养层细胞系STO及ESC细胞系R1中CREG基因的表达。利用Lipofectamine 2000向STO细胞中分别转染RNA干扰空对照载体,含有无意义随机序列的对照载体以及含有4种不同CREG干扰序列的载体。用1.0μg/ml嘌呤霉素筛选1 w,荧光显微镜下挑取绿色荧光蛋白表达较高的克隆进行扩增。Western Blot方法鉴定CREG基因干扰效率,获得CREG表达最低的饲养层细胞克隆。将ESC R1接种到该克隆上,不添加白血病抑制因子,连续培养3代,用碱性磷酸酶染色判断其是否分化。结果:R1几乎不表达CREG,而STO细胞高表达CREG。Western Blot结果证实筛选到的STO克隆3A干扰效果最好,达到85%。在不添加白血病抑制因子的情况下,碱性磷酸酶染色表明R1细胞在该株饲养层细胞上连续培养3代后未见明显分化。结论:成功获得CREG低表达饲养层STO细胞,为深入探讨CREG对ESC自我更新的作用及机制奠定了基础。     

用pGAP启动子在P.pastoris中组成型表达cbhⅡ基因

用套叠PCR法扩增木霉的cbh Ⅱ基因,以EcoR I和Not I双酶切将其克隆进P.pastoris表达载体pGAP9K,获得重组表达质粒pGAP-cbh Ⅱ。通过电转法将其cbhⅡ基因重组于P.pastoris基因组,筛选高G418抗性的克隆作为工程菌。用葡萄糖作为碳源摇瓶发酵3 d,分泌的重组蛋白CBHⅡ达到50 mg/L。用CMC酶活法测定发酵液中的CMC酶活力为2.05 U/mL。     

内含子中正筛选标记neo基因在转录中的剪切研究

目的:研究插入内含子中的正筛选标记基因neo在转录中的剪切情况。方法:克隆了猪血清白蛋白基因5'端调控序列,以猪基因组DNA为模板,P10/P11为引物,PCR扩增猪血清白蛋白基因翻译终止密码子后2.9kb的3'端调控序列;以pEGFP-1为模板,P400/P401为引物PCR扩增绿色荧光蛋白(EGFP)基因,插入猪血清白蛋白基因5'端调控区之后,在3'端调控序列的内含子中靠近N端的序列中插入正筛选标记基因neo,构建了表达EGFP的真核表达载体pEXp11。转染人肝癌细胞系HepG2,通过G418药物筛选获得稳定转染的抗药性细胞克隆。提取抗性细胞克隆基因组RNA并进行反转录,获得cDNA序列。结果:用引物D400/D401及分别位于neo基因和3'端调控序列上的一对引物D394/D357进行PCR检测,其中D394/D357并未扩增出目的条带。结论:插入内含子中的neo基因在转录过程中可随内含子一起被剪切。     

G418和潮霉素B双重抗性小鼠胚胎干细胞饲养层的制备

通过脂质体转染的方法,先后将含有neo基因的质粒pWL／neo和含有潮霉素基因的质粒导入NIH3T3细胞中,利用G418和潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,经500μg／ml的G418和300μg／ml潮霉素B压力筛选后,获得了具有G418和潮霉素B双重抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,用PCR法特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段。生长在双抗NIH3T3细胞饲养层上ES细胞基本保持正常ES细胞特征,成功地培育了G418和潮霉素双重抗性的NIH3T3细胞,为进行pTet-on和pTRE-H-Insulin目的基因电转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。     

敲除NDRG2 基因的AD模型小鼠的构建与鉴定

目的:构建与鉴定NDRG2基因全身敲除的阿尔茨海默症(AD)小鼠模型。方法:将NDRG2-/-、APP/PS1进行饲养杂交繁殖,将通过PCR技术鉴定基因型为NDRG2+/-APP/PS1的子一代小鼠再与NDRG2-/-小鼠回交获得子二代小鼠,提取子二代小鼠的基因组DNA再利用PCR方法:扩增NDRG2和APP/PS1基因片段并进行琼脂糖凝胶电泳检测获得4种基因型的小鼠。结果:选取基因型为NDRG2-/-APP/PS1的小鼠即为全身NDRG2敲除且淀粉样蛋白基因过表达的阿尔茨海默症模型小鼠。应用PCR方法:鉴定NDRG2基因全身敲除的AD小鼠模型。成功获得NDRG2基因全身敲除的AD小鼠,该基因型小鼠有繁殖能力,其繁殖符合孟德尔遗传规律。结论:成功构建NDRG2基因敲除的阿尔茨海默症模型小鼠,为进一步研究NDRG2基因在阿尔茨海默症病理发展过程中的作用机制及新的治疗方法的研究提供模型基础。     

肝脏特异性CD36基因敲除小鼠的制备及鉴定

目的:运用Cre/Loxp重组酶系统构建肝脏特异性CD36基因敲除小鼠并进行鉴定和验证,为研究CD36的生物学功能奠定基础。方法:构建CD36打靶载体,电转转染胚胎干细胞,通过长链PCR筛选出正确同源重组的阳性克隆,阳性胚胎干细胞克隆经扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合小鼠,再与Flp小鼠交配筛选获得Flox杂合子小鼠,该小鼠与引进的Alb-Cre小鼠交配,在F3代获得CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠,即为肝脏特异性CD36敲除小鼠。采用PCR鉴定小鼠基因型,PCR、实时荧光定量PCR和Western blot验证小鼠肝脏CD36敲除效果,Western blot检测小鼠肾脏、脂肪和心肌组织CD36表达情况,HE染色观察小鼠肝脏形态学改变。结果:建立了CD36基因的Flox杂合子小鼠,与Alb-Cre小鼠交配后,在F3代筛选出CD36fl/fl:AlbCre-和CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠,DNA水平证实CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠肝脏CD36基因通过Cre/Loxp重组酶系统被敲除。与CD36fl/fl:Alb-Cre-基因型小鼠相比,CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠肝脏CD36mRNA和蛋白表达水平显著降低,肾脏、脂肪和心肌组织CD36蛋白表达无差别,肝脏形态学特征无明显差异。结论:通过Cre/Loxp重组酶系统成功构建了肝脏特异性CD36基因敲除小鼠,为研究CD36在肝脏代谢和肝脏疾病中的功能提供了动物模型。     

G418抗性HEK293细胞的培育

目的　培育具有G418抗性的HEK2 93细胞 ,用于建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型。方法　通过脂质体转染的方法 ,将含有neo基因的质粒pIRESneo导入HEK2 93细胞中 ,利用G418的选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行了PCR鉴定。结果　经 6 0 0 μg ml的G418压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性细胞的形态和生长速度与筛选前细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论　成功地培育了G418抗性HEK2 93细胞 ,为建立猪内源性反转录病毒感染人HEK2 93细胞的模型奠定了基础。     

人血清白蛋白基因的打靶研究

为获得整合有人血清白蛋白(HSA)基因的猪胎儿成纤维细胞克隆,从猪基因组文库中杂交筛选得到猪血清白蛋白(PSA)基因全序列35kb并克隆了人血清白蛋白cDNA序列,扩增猪血清白蛋白基因5′调控序列7.2kb片段及第一内含子至第四内含子2.8kb的片段;构建了含有neo及tk正负筛选标记基因的人血清白蛋白基因打靶载体,并验证了neo基因的有效性。将线性化的打靶载体通过电击转染的方法整合到猪胎儿成纤维细胞基因组中,利用G418及GANC进行细胞克隆的抗药性筛选,PCR及Southern blot鉴定抗药性细胞克隆,最终获得3个发生同源重组的细胞克隆。这为下一步进行体细胞核移植制备生产人血清白蛋白转基因猪奠定了基础。     

利用启动子缺陷型打靶载体敲除五指山小型猪GGTA1基因

目的:获得α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)基因敲除的五指山小型猪胎儿,为异种器官移植研究提供基础平台。方法:以新霉素磷酸转移酶基因(neo)为筛选标记基因构建启动子缺陷型打靶载体,打靶载体线性化后用电转染法将其导入胎儿成纤维细胞中,转染后的细胞经G418筛选后,用PCR法检测药物抗性的细胞克隆,对阳性细胞进行核移植构建重构胚胎及胚胎移植。结果:转染后,经筛选共得到176个具有G418抗性的细胞克隆,经PCR检测,其中2个细胞克隆发生了同源重组;以其中1个GGTA1+/-细胞克隆为供体细胞进行核移植,将重构胚移植到2头自然发情的受体母猪中,1头受体妊娠;第37 d将代孕母猪处死,获得2个胎儿,经PCR和Southern印迹鉴定,均为GGTA1单等位基因敲除胎儿。结论:构建了五指山小型猪GGTA1基因部分外显子4区域敲除的启动子缺陷型打靶载体,获得了GGTA1单等位基因敲除的胎儿,为培育GGTA1基因敲除的五指山小型猪奠定了基础。     

牛朊蛋白基因prnp敲除载体的构建及真核细胞转染

利用正负筛选策略(Positive-negative selection,PNS)对中靶细胞进行富集是提高体细胞基因打靶效率常用的策略之一。将动物的朊蛋白基因prnp敲除,使其不能表达朊蛋白(传染性海绵状脑病的致病蛋白),从而使其具有抵抗Prion病感染的能力。本研究采用正负筛选策略,构建了牛prnp基因的双等位基因敲除载体,经内切酶Sac Ⅱ线性化后,再通过电穿孔转染牛胎儿成纤维细胞,分别用600μg/mL G418、200nmol/mL Ganciclovir(GCV)进行正负药物筛选,最终获得了176个药物抗性细胞克隆,进一步采用PCR、测序、间接免疫荧光试验及Western blotting试验对细胞克隆进行鉴定,结果表明,其中的9个细胞克隆为中靶细胞,证明牛prnp基因被成功敲除。本研究为牛prnp的敲除提供了可行性依据,并为体细胞核移植生产敲除朊蛋白基因的转基因动物提供供体细胞。