白细胞介素-2受体在乳腺癌MCF-7细胞的表达

目的 :观察乳腺癌MCF 7细胞上白细胞介素 2受体 (IL 2R)α、β和γ链的表达、IL 2对MCF 7细胞增殖的作用及雌激素对三条链表达的影响。方法 :使用特异性IL 2R多克隆抗体以免疫细胞化学方法和流式免疫荧光法检测MCF 7细胞上IL 2R的表达 ,以MTT法及3 H TdR掺入法检测细胞增殖情况。结果 :MCF 7细胞上存在IL 2Rα、β、γ的免疫阳性物质 ,其中IL 2Rγ的表达要强于IL 2Rα、β的表达 ;10 -6mol/L浓度的雌二醇可促进IL 2Rα、β的阳性细胞数及IL 2Rγ的免疫阳性物质的含量 ;IL 2在 10 0U/ml至 10 0 0U/ml的浓度范围内可显著促进MCF 7细胞的增殖。结论 :MCF 7细胞上存在IL 2R且其表达受雌二醇的调节 ,IL 2可能通过IL 2R影响MCF 7细胞的增殖     

PBK/TOPK在乳腺癌细胞中介导MEK非依赖性ERK激活中作用机制分析

该文探讨了乳腺癌细胞中表皮生长因子(EGF)介导的MEK非依赖性ERK激活通路。Western blot检测EGF刺激下,siRNA抑制MEK1/2后的T47D细胞的p-ERK水平,以验证T47D细胞中存在EGF介导的MEK非依赖性ERK激活的通路。接着使用可能参与MEK非依赖性ERK激活的激酶的小分子抑制剂抑制相关激酶(AC、PKC、Src、PI3K、PDK1和Akt)活性后,检测T47D细胞EGF介导ERK的磷酸化水平。siRNA抑制MEK1/2表达后,T47D细胞在EGF刺激后的仍保留部分p-ERK,即在T47D细胞中,存在EGF介导的MEK非依赖性的ERK磷酸化通路。小分子抑制剂抑制AC、PKC、Src对MEK非依赖性ERK激活途径影响不大。而使用小分子抑制剂抑制PI3K、PDK1和Akt后,ERK的磷酸化水平显著降低,提示PI3K/Akt通路下游的激酶参与T47D中EGF介导的MEK非依赖性ERK激活途径。siRNA干扰PI3K/Akt通路下游PBK/TOPK后并使用U0126抑制MEK功能后,几乎检测不到p-ERK,提示PBK/TOPK参与T47D细胞中EGF介导的MEK非依赖性ERK激活途径。乳腺癌抗雌激素药物耐药株T47D细胞存在EGF介导的MEK非依赖性ERK激活途径,且该途径受PI3K/Akt下游的PBK/TOPK调控。     

TGF-β1以受体和Smad7依赖的方式活化ERK

目的:探讨人永生化BEP2D细胞中TGF-β活化ERK/MAPK通路的机制。方法:用RNA干扰的方法设计siRNAs使人永生化BEP2D细胞中TβRⅡ、Smad7基因沉默,用Westernblot分析TGF-β1诱导的ERK激酶磷酸化的变化。结果:当Smad7表达沉默后,TGF-β1诱导的ERK激酶磷酸化水平显著降低;当TβRⅡ和Smad7表达同时发生沉默后,细胞内TGF-β1诱导的ERK激酶磷酸化水平进一步降低到基础水平以下。结论:TGF-β1以受体和Smad7依赖的方式活化ERK/MAPK通路。     

14-3-3参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径研究

本室以前已经报道了G蛋白偶联受体APJ的内源性配体多肽,apelin-13,通过激活ERK1/2促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.本文研究14-3-3信号蛋白是否参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径,探讨apelin/APJ系统的细胞信号转导机制.组织贴块法培养大鼠胸主动脉VSMCs;Western blotting方法检测14-3-3、pRaf-1、Raf-1、pERK1/2、ERK1/2、cyclinD1、cyclinE的表达;MTT方法观察14-3-3抑制剂Difopein对VSMCs的增殖作用;免疫共沉淀方法检测14-3-3和Raf-1蛋白复合物的形成.Western blotting方法结果显示,apelin-13(0、0.5、1、2、4μmol/L)浓度依赖性刺激大鼠VSMCs 14-3-3表达、Raf-1和ERK1/2磷酸化,以2μmol/L最为明显;2μmol/L apelin-13时间依赖性刺激大鼠VSMCs 14-3-3表达、Raf-1和ERK1/2磷酸化,在4 h增加最为显著;14-3-3蛋白抑制剂Difopein明显抑制apelin-13诱导的Raf-1磷酸化、ERK1/2磷酸化、cyclinD1及cyclinE表达;免疫共沉淀方法发现apelin-13诱导14-3-3与Raf-1结合增加,而Difopein明显抑制两者结合;MTT法显示Difopein明显抑制apelin-13诱导的血管平滑肌细胞增殖.上述结果表明,Apelin-13通过14-3-3/Raf-1复合物-ERK1/2信号转导通路促进大鼠血管平滑肌细胞增殖.     

BPA 激活 GPER-EGFR-ERK1 /2 信号通路诱导乳腺癌细胞增殖

目的:研究雌激素G蛋白偶联受体(G protein-coupled estrogen receptor,GPER)-表皮生长因子受体(epidermal growthfactor receptor,EGFR)-细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号通路在双酚A促乳腺癌细胞SKBR-3增殖中的作用。方法:采用CCK8试剂盒检测SKBR-3细胞的增殖情况,利用Western Blot观察ERK1/2磷酸化变化。结果:与对照组相比,10-11~10-7 M浓度的双酚A具有促乳腺癌细胞增殖作用,10-9M浓度的双酚A可诱导细胞增殖最大效应(细胞活力高于对照组约38.84%,P<0.001);预孵GPER、EGFR、ERK1/2特异性抑制剂G15、AG-1478、PD98059后,双酚A诱导的乳腺癌细胞增殖明显减少,细胞活力与单纯双酚A(10-9 M)处理相比降低约14.27%、12.23%和17.98%(P<0.05);双酚A(10-9 M)处理细胞0.5、1、3小时后,发现磷酸化的细胞外信号调节激酶(p-ERK)的表达明显高于对照组,双酚A可快速激活ERK1/2;而阻断GPR30和EGFR后,ERK1/2的磷酸化表达减少。结论:双酚A诱导的乳腺癌细胞增殖可能与GPR30-EGFR-ERK1/2信号通路有关,但不是唯一通路。深入研究双酚A对促进乳腺癌细胞增殖机制,可能为乳腺癌的防治提供新的方向。     

IQGAP1通过ERK信号通路促进非小细胞肺癌细胞增殖

该研究探讨了IQGAP1(IQ domain GTPase-activating protein 1)对非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)细胞增殖的影响及其对ERK信号通路的调节作用。将内源性IQGAP1低表达的A549细胞中分为空白组、空载组和IQGAP1过表达组;将内源性IQGAP1高表达的H1299细胞中分为空白组、阴性对照si RNA组和IQGAP1 si RNA组;采用ERK1/2磷酸化抑制剂U0126处理上述两株细胞。MTT法检测细胞增殖能力,Western blot法检测ERK1/2和p-ERK1/2蛋白质水平。结果显示,在A549细胞中,过表达IQGAP1能促进细胞增殖并促进ERK1/2磷酸化;在H1299中,敲低IQGAP1表达能够抑制细胞增殖并下调ERK1/2磷酸化水平。用U0126处理后能抑制IQGAP1对细胞增殖的促进作用。研究结果表明,IQGAP1可通过ERK信号通路促进体外非小细胞肺癌细胞增殖。     

SDF-1α对胶质瘤细胞U87过氧化氢损伤的保护作用

目的：探讨基质细胞衍生因子1α（SDF-1α）对过氧化氢（H2O2）损伤人脑胶质瘤细胞U87的保护作用及机制。方法：双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）检测胶质瘤细胞U87自分泌SDF-1α;细胞增殖实验研究外源SDF-1α对U87细胞增殖的影响;SDF-1α作用U87 12小时后,0.7 mM H2O2处理6小时,流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白质免疫印记实验（western blot）检测SDF-1α对U87细胞中蛋白激酶B（Akt）和细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）磷酸化的影响。结果：胶质瘤细胞U87自身几乎不分泌SDF-1α,24小时内外源性SDF-1α对U87细胞增殖无明显影响;H2O2损伤后,SDF-1α预处理组细胞存活率高于对照组,凋亡率和死亡率低于对照组,差异具有统计学意义;Western blot显示SDF-1α处理能够诱导U87细胞Akt和ERK1/2的快速磷酸化。结论：SDF-1α能够提高H2O2损伤的U87细胞存活率,降低凋亡率和死亡率,其机制可能与磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）-Akt和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）-ERK1/2通路的激活有关。     

SDF-1α对胶质瘤细胞U87 过氧化氢损伤的保护作用

目的:探讨基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)对过氧化氢(H2O2)损伤人脑胶质瘤细胞U87的保护作用及机制。方法:双抗体夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测胶质瘤细胞U87自分泌SDF-1α;细胞增殖实验研究外源SDF-1α对U87细胞增殖的影响;SDF-1α作用U87 12小时后,0.7 mM H2O2处理6小时,流式细胞术检测细胞凋亡率;蛋白质免疫印记实验(western blot)检测SDF-1α对U87细胞中蛋白激酶B(Akt)和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)磷酸化的影响。结果:胶质瘤细胞U87自身几乎不分泌SDF-1α,24小时内外源性SDF-1α对U87细胞增殖无明显影响;H2O2损伤后,SDF-1α预处理组细胞存活率高于对照组,凋亡率和死亡率低于对照组,差异具有统计学意义;Western blot显示SDF-1α处理能够诱导U87细胞Akt和ERK1/2的快速磷酸化。结论:SDF-1α能够提高H2O2损伤的U87细胞存活率,降低凋亡率和死亡率,其机制可能与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-Akt和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)-ERK1/2通路的激活有关。     

酶标法检测促胰岛素分泌肽融合蛋白生物学活性

[目的]建立促胰岛素分泌肽融合蛋白(Exendin-4-Fc fusion protein,简称E4F4)生物学活性的检测方法,并对新建方法进行优化及验证。[方法]采用U2OS/GLP-1R转基因细胞系,通过酶标法检测胞内cAMP含量的改变来测定E4F4生物学活性。[结果]U2OS/GLP-1R转基因细胞系在30代以内均可用于E4F4生物学活性的检测,细胞接种密度为1.2×10^(4)/孔,药物作用时间30 min为该方法的最佳检测条件;在0.00305~50μg/mL范围内,剂量效应曲线呈典型的S型半对数曲线;3批E4F4成品分别进行加标回收试验,回收率均在80%~120%之间;对同一批E4F4成品独立测定8次,CV%值为12.81%;3批E4F4成品在3个工作日内进行生物学活性检测,每批分别测定3次,9次试验的CV%为16.73%。[结论]经过细胞接种密度、细胞代次和药物作用时间的优化,建立的U2OS/GLP-1R细胞酶标法专属性强,精密度好,准确性高,可作为E4F4生物学活性的常规检测方法。     

珊瑚树Vibsane型二萜类化合物对人体HepG2细胞增殖的影响及其机制

目的：探讨珊瑚树vibsane型二萜类化合物对肝癌HepG2细胞增殖的影响及其机制,为研发新型天然植物类抗肿瘤药物提供实验依据。方法：采用噻唑蓝比色法及苔盼蓝染色计数法观察珊瑚树vibsane类二萜类化合物对不同肿瘤细胞增殖的影响;应用流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡,利用Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7试剂盒检测vibsane二萜类化合物1#对HepG2细胞内Caspase-3酶活性的影响。结果：活性筛选发现vibsane型二萜类化合物1#显著抑制人肝癌HepG2细胞增殖,构效分析表明化合物C11位连接侧链的基团修饰影响其细胞增殖抑制活性。此外,HepG2细胞对1#化合物最敏感,1#化合物抑制其增殖具有剂量和时间依赖性。机制研究显示1#化合物诱导HepG2细胞发生明显的细胞周期G0/G1期阻滞,具有时间和剂量效应;同时,较高浓度1#化合物（5-10μmol/L）引起HepG2细胞凋亡明显增加,并剂量依赖性诱导细胞内Caspase3/7激活。结论：珊瑚树vibsane型二萜类化合物能够明显抑制人肝癌HepG2细胞增殖,其可能通过诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。